酶穩定化技術及其在洗滌劑開發中的應用

谷志靜，趙澤華，胡衛華，何永志，趙文忠

（1.拉芳家化股份有限公司，廣東 汕頭 515065；2.中國科學院-拉芳發質研究中心，北京 100101）

酶穩定化技術及其在洗滌劑開發中的應用

谷志靜1,2，趙澤華1，胡衛華1，何永志2，趙文忠1

（1.拉芳家化股份有限公司，廣東 汕頭 515065；2.中國科學院-拉芳發質研究中心，北京 100101）

酶的穩定性問題是影響其在洗滌劑中應用性能的重要因素。綜合運用蛋白質工程﹑化學修飾﹑穩定劑添加和微囊包載技術可增強酶的穩定性，提升加酶洗滌劑的使用效果。本文概述了4種酶穩定化技術的基本原理及其研究現狀；介紹了酶穩定化技術在洗滌劑開發中的應用進展和發展前景。

酶制劑；穩定性；洗滌劑；應用

1．前言

早在1913年，Ro..hm就已將胰腺提取物用于洗滌劑的預浸泡組分Burnus，開創了生物酶在洗滌劑工業中應用的歷史。國外已商品化的洗滌劑用酶主要為水解酶類，包括堿性蛋白酶﹑淀粉酶﹑堿性纖維素酶﹑脂肪酶以及它們的復合物；新開發的抗染料轉移功能或消毒殺菌效用的氧化還原酶類（如過氧化氫酶）也具有較好的應用前景。

生物酶作為洗滌助劑是合成洗滌劑工業發展過程中的重大技術進步之一，它促進了洗滌劑工業的可持續發展：降低了洗滌劑中表面活性劑和三聚磷酸鈉的用量，有助于低磷或無磷洗滌劑的開發；能夠改善洗滌性能，但自身無毒并能完全生物降解，可以減少污染物質的排放；降低洗滌溫度，減少漂洗次數，有利于節能節水。

但是，由于生物酶自身易于降解以及洗滌劑配方技術的復雜性，如表面活性劑﹑漂白劑﹑蛋白酶等配方組分以及pH﹑溫度等配方條件的影響，酶的穩定性成了加酶洗滌劑配方的突出問題[1-2]。酶制劑公司和洗滌用品開發商通過綜合運用蛋白質工程技術﹑化學修飾技術﹑穩定劑添加和微囊包載技術，來提高生物酶在洗滌劑中的穩定性，改善其使用效果。

2．蛋白質工程技術

蛋白質工程技術主要是對已知酶分子一級結構的改變，即酶的主鏈氨基酸的替換修飾。隨著二十世紀70年代基因重組技術的建立，人們通過生產菌株和表達系統的改造，大幅度提高了重組酶的表達效率；80～90年代，通過基因重組技術結合計算機輔助設計，逐漸形成了以理性設計和定向進化策略為主的蛋白質工程技術。

借助蛋白質工程技術，人們可以根據實際應用需要改進重組酶的性能，使酶制劑得以實現規模化應用。在洗滌劑用酶的開發過程中，經常采用理性設計和定向進化相結合的改性方式來改善酶的穩定性及綜合洗滌效能。目前，洗滌用品工業中應用的商品化酶制劑80%已升級為性能更加優越的蛋白質工程突變體。例如，諾維信公司開發的蛋白酶制劑EverlaseTM是SavinaseTM的抗漂白劑突變體；而DurazymTM（諾和諾德公司，丹麥）﹑RelaseTM（諾和諾德公司，丹麥）﹑MaxapemTM（Gist-Brocades，荷蘭）﹑Purafect OxPTM（杰能科公司，美國）﹑WuxiTM（無錫聯合生物制品有限公司，中國）都是蛋白質工程重組酶。此類酶制劑在洗滌用品工業應用所受到的限制較食品行業少，因而獲得了更為廣泛的認可。

2.1 理性設計及應用

對于那些三級結構已經比較清楚的酶分子，可以通過PCR﹑寡核苷酸盒技術，對特定區域的核苷酸序列進行定點突變或進行一段序列的置換等理性設計，進而改變酶蛋白的功能性質。理性設計實驗的工作量相對較小，但前提是熟悉酶的結構及其與功能的關系，并需要大量的生物信息學輔助工作。

關于蛋白質工程的模式酶——枯草芽孢桿菌蛋白酶（Subtilisin），現已有50多種高清晰度的X-ray結構解析模型。結合同源序列比對和蛋白結構分析，確定合適的位點進行突變，然后通過Kcat/Km﹑溫度穩定性﹑pH穩定性﹑氧化穩定性﹑表面活性劑穩定性等方面對酶學性質進行分析，選擇建立適合突變體的設計流程，使得理性設計在理論研究的基礎上發展成為改善酶穩定性的捷徑。

根據酶制劑公司和日化公司發表的專利技術總結，與酶的洗滌穩定性相關的位點修飾包括：將Subtilisin BPN'﹑蛋白酶K﹑Subtilisin Carlsberg疏水區域的疏水氨基酸Pro129﹑Pro131﹑Ile165﹑Tyr167﹑Tyr171及其臨近的非疏水氨基酸Glu136﹑Gly159﹑Ser164﹑Arg170﹑Ala194﹑Gly195位點替換為更疏水的氨基酸殘基，可以提高酶對離子強度的穩定性，從而使之能耐受硬水洗滌條件；改變金屬離子的結合位點，采用負電荷的氨基酸置換Subtilisin鈣離子結合位點的氨基酸，如將Subtilisin BPN'﹑Carlsberg﹑DY的Gly131替換為Asp和/或將Pro172替換為Asp或Glu，有利于加強鈣離子和結合位點的靜電吸引，從而提高酶的穩定性；置換Subtilisin BPN′未形成二硫鍵的甲硫氨酸Met222，有利于提高酶的抗氧化性和對漂白劑的耐受性[3]。此外，Acevedo等人通過對南極嗜冷細菌的Subtilisin序列分析和定點突變，證實284位的丙氨酸對其嗜低溫性有關鍵作用，為低溫蛋白酶的定點突變設計提供了有效的理論依據[4]。

2.2 定向進化及應用

定向進化是在不需要事先了解蛋白質空間結構的情況下，模擬自然進化機制，通過對編碼基因的體外隨機突變﹑重組和定向篩選，獲得具有改進功能或全新功能的酶蛋白。體外定向進化是蛋白質工程的新策略，其快速發展有力地推動了生物酶制劑的商業化開發。定向進化以隨機誘變和體外重組構建序列多樣性文庫為研究基礎。

傳統的隨機誘變方法操作繁瑣，已逐漸為新的體外基因重組技術所取代。體外重組是基于PCR原理發展起來的突變文庫構建方法，包括易錯PCR（error PCR）和體外隨機拼接（DNA shuffling）兩種方案。前者在酶基因的PCR擴增反應中，利用TaqDNA多聚酶不具有3'～5'校對功能，以每個基因2～5個堿基的替換比率向目的基因中引入突變；后者是將進化上相關的或者獨立的基因片段重新組合，從而引入大量突變。

21世紀以來，研究人員先后開發了序列飽和突變法（sequence saturation Mutagenesis，SeSaM）﹑不依賴于同源性的蛋白質重組方法（sequence homology-independent protein recombination，SHIPREC）等20多種改進的序列多樣性文庫構建方法，特別是小型但正向突變率較高的突變庫的構建技術以及系列由shuffling衍生出的嵌合酶構建技術，克服了傳統定向進化策略效率低﹑假陽性率高的弊端，加速了定向進化技術的應用進程。Bryan實驗室通過易錯PCR引入12個位點突變，獲得了高活性﹑高穩定性的蛋白酶復合進化突變體，在比活性沒有改變的情況下，半衰期提高到原來的15000倍[5]；Li等人通過SeSaM定向進化方法，對Subtilisin E進行趨化性改造，獲得對變性劑GdmCl和表面活性劑SDS的耐受性顯著增強的突變體SeSaM1-5（S62I/A153V/G166S/ I205V），該突變體在2% SDS中的半衰期延長至野生型的27倍[6]；Martinez等則通過SeSaM隨機突變和傳統的微孔板篩選法，獲得了在15℃低溫時酶活提高1.5倍﹑60℃高溫時半衰期延長了100倍的蛋白酶突變體MF1，它既可用于低溫型洗衣液，也可用于高溫的餐具洗滌劑[7]。

3．化學修飾技術

在體外將酶分子通過人工的方法與一些化學基團進行共價連接，從而改變酶的結構和性質，即酶的化學修飾。化學修飾為蛋白側鏈修飾，作用于蛋白質分子的氨基﹑羧基﹑羥基﹑巰基和酰胺鍵等部位。追溯酶化學修飾的研究歷史，早在20世紀50年代末就已經有人開始了關于酶的化學修飾技術的探索，當時主要用來研究酶的結構與功能的關系；20世紀70年代末以后，化學修飾技術逐漸向應用過渡。現有的化學修飾技術研究結果顯示，生物相容性大分子修飾和肽鏈交聯技術適合于洗滌劑用酶制劑的穩定性改造[8]。

3.1 大分子修飾

大分子修飾是一種利用水溶性大分子與酶結合，使酶的空間結構發生某些精細的改變，進而改變酶的理化性質與功能的方法。大分子修飾劑本身是多聚電荷體，它能在酶分子表面形成“緩沖外殼”，抵御外界環境的極性變化，并通過靜電斥力或者空間障礙阻擋抑制劑﹑蛋白酶的接近，維持酶活性部位微環境相對穩定。

淀粉﹑環糊精﹑聚蔗糖等大分子糖苷經過氧化處理后修飾酶蛋白具有較好的穩定作用。聚乙二醇（PEG）既能溶于水又能溶于大多數有機溶劑，且其自身沒有抗原性﹑毒性，生物相容性好，所以已成為日化﹑醫藥﹑食品領域應用最為廣泛的大分子修飾劑，既可用于提高生物酶的體外的穩定性，又可用于改善生物酶的體內穩定性。

3.2 蛋白質肽鏈交聯

蛋白質肽鏈交聯指通過具有兩個反應活性部位的雙功能試劑，在相隔較近的兩個氨基酸殘基間搭橋，形成多肽鏈內﹑多肽鏈間或者蛋白質分子之間的交聯，而不會引起蛋白質構象的重大改變。這種方法也稱為蛋白修飾。

雙功能交聯試劑分為同型交聯劑和異型交聯劑。前者主要與胺基反應，如戊二醛（PGA）；后者一端與巰基側鏈作用，另一端與胺基作用，如碳二亞胺（EDC）。其他常用的交聯劑有羰基二咪唑﹑異氰酸衍生物﹑雙氮聯苯﹑N,N-聚甲烯雙碘丙酮酰胺和N,N-乙烯雙馬來酰亞胺等。

采用多反應基團的交聯劑修飾可與酶形成多點交聯，使酶的天然構象產生“剛性”結構，從而增強酶天然構象的穩定性。而且酶分子上許多敏感基團交聯上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。Subtilisin Carlsberg通過PEG修飾和羰基二咪唑交聯固定，在洗滌劑中半衰期可延長約2倍[9]。

4．穩定劑添加技術

在含有大量水分的液體洗滌劑中，酶通常更不穩定。極性的溶劑﹑緩沖劑以及帶電荷的表面活性劑等組分可能促使儲存過程中酶的三級結構解折疊，而且蛋白酶在水溶液中更容易降解其他生物酶。添加適量穩定介質以抑制蛋白酶活性﹑調節電荷平衡﹑加強滲透保護，從而保障生物酶結構的剛性是解決液洗用酶穩定性的主要技術方案，即穩定劑添加技術。目前，該技術的研究重點是開發高效的蛋白酶抑制劑和適合配方的復合穩定體系。

4.1 蛋白酶可逆抑制劑

蛋白酶的可逆抑制劑能夠與蛋白酶的活性位點實現可逆結合，它可以使液體酶在貨架期間是穩定的﹑無活性的，而使用時則以不同方式釋放活性。有機硼酸鹽作為枯草芽孢桿菌蛋白酶抑制劑，其穩定效果因取代基不同而不同，甲基﹑丁基﹑2-環氧乙烯基硼酸鹽的抑制作用較差，以甲基硼酸鹽效果最弱，芳香基取代的有機硼酸鹽抑制作用較強。

21世紀以來，諾維信公司和寶潔公司都著重開發含芳基的有機硼酸鹽作為蛋白酶抑制劑，并發現芳香基團-3位與硼酸縮合的有機硼酸鹽的效果最優[10-11]。然而，動物實驗結果將硼酸鹽確定為第二類生殖毒性化合物，因此人們正積極尋找新的穩定劑作為液體洗滌劑中硼酸鹽替代物。

研究人員發現，在加入蛋白酶的液體洗滌劑中，α-羥基羧酸鹽對酶的穩定性起到關鍵作用。特別是含芳香基的羧酸鹽衍生物更有效，使之成為新一代蛋白酶抑制劑的主流產品。諾維信公司近期開發了3-氯苯甲酸﹑4-氯苯甲酸﹑3-氯苯乙酸﹑3,5-二氯苯甲酸﹑3-(3-氯苯基)丙酸等多種帶有芳香基的羧酸鹽衍生物作為枯草芽孢桿菌蛋白酶抑制劑，其最低添加量只有0.001%（w/w），因而可以大大降低配方成本。而且，它較硼酸鹽具有更好的生物降解性[12]。

4.2 復合穩定體系

洗滌劑的表面活性劑組成以及其pH范圍﹑水含量等理化條件，都會在不同程度上影響蛋白酶抑制劑的穩定作用[2]。因此，需要根據洗滌劑的配方特點，設計蛋白酶抑制劑和小分子添加劑組成的復合穩定體系。其主要設計原理是，通過小分子添加劑2～6元醇降低組合物中的水含量（≤70%），這樣蛋白酶可逆抑制劑才能有效地封閉蛋白酶活性區。

市售加酶液體洗滌劑的穩定體系主要由硼酸鹽（1%～3%）和丙二醇/丙三醇（＞5%）組成，但液體洗滌劑配方中不能配用過多的陰離子表面活性劑。例如，寶潔公司2009年開發設計的一款產品，就是由1%～5%硼酸鹽﹑0.1%～7%丙二醇﹑10～50毫摩爾CaCl2.2H2O 組成的穩定體系，在40%～70%的水含量條件下，可增強淀粉酶﹑蛋白酶﹑堿性磷酸酯酶等多種生物酶的穩定性[13]。

在大量的蛋白酶抑制劑和穩定體系開發的基礎上，2012年陶氏化學公司開發了只添加1～3%等比例混合硼酸鹽和α-羥基單羧酸鹽的酶穩定體系，其中α-羥基單羧鹽以乳酸﹑扁桃酸的鈣鹽為佳，硼酸鹽以苯基硼酸鹽為佳。該公司宣稱，這種穩定體系在pH2～10范圍內對多種酶濃縮液和洗滌劑廣譜適用[14]。可見，洗滌配方中酶的穩定體系正向著成分簡化﹑濃度降低，但性能更加高效和廣譜的方向發展。

5．微囊包載技術

利用成膜材料（簡稱壁材），將固體或液體活性物以及易揮發的原料包裹成大小為1～5000μm的封閉囊，使囊內空間與囊外空間隔開，統稱為微囊包載技術。通過該技術，可將生物酶與洗滌護理產品中的破壞性組分進行隔離，以保護酶的生物學活性。

早期微囊包載酶制劑主要以顆粒酶的形式用于固體洗衣粉。這些顆粒酶由含酶核心結構和包衣層構成，制備材料按用途分為成膜劑﹑黏合劑﹑填充劑﹑制粒劑及抑制粉塵的脂肪酸鹽或高級醇。二十世紀90年代后，微囊化酶制劑的開發應用領域拓展至液體洗滌劑。因此，微囊自身的機械穩定性﹑熱穩定性和凍融穩定性已成為選擇和評價液體洗滌劑微囊的重要指標。

微囊化研發過程中，要根據包芯性質﹑組合物配伍性﹑活性物釋放環境等具體應用條件，選用不同的壁材和制備方法。目前開發的酶微囊，主要以無機鹽或聚蔗糖為填充劑或滲透平衡劑，以合成聚合物（聚乙二醇﹑乙烯基聚合物﹑吡咯烷酮聚合物﹑丙烯酸聚合物﹑乙基纖維素聚合物等）或天然大分子化合物（海藻酸（鹽）﹑殼聚糖﹑角叉菜膠﹑黃原膠﹑脂肪酸﹑蠟﹑膨潤土等）以及其復合材料作為包衣。根據囊壁形成的原理，微囊包載方法可概括為化學反應法﹑物理機械法﹑物理化學法三大類，工藝流程分為芯材分散﹑壁材加入﹑壁材沉積及壁材固化四個主要步驟[15,16]。

5.1 化學反應法

化學反應法微囊包載技術是指利用單體小分子發生聚合反應，生成高分子成膜材料包覆芯材的微囊制備方法。這種技術主要包括界面聚合法和原位聚合法。諾維信公司采用原位聚合法開發了一種由環氧乙烷（EO）﹑環氧丙烷﹑丙烯酸（EE）或乙烯胺的低分子量聚合體（＞10個單體）構成的二元共聚物（如PEO-40-PEE-37）或三元共聚物（如PEO-40-PEE-74-PEO-40）為主要壁材的微囊，其共聚物組分占微囊的50%～100%（w/w）。此種微囊囊壁既有親水性又有疏水性，既可以包載酶等水溶活性物也可以包載油溶性的香精[17]。

5.2 物理機械法

指利用機械或其他物理作用形成囊壁的方法，常用噴霧干燥法﹑氣懸浮成膜法﹑真空蒸發沉積法﹑包結絡合法﹑溶劑蒸發法﹑擠壓法等。其中，噴霧干燥最適合工業化批量生產，其主要工藝為：芯材和殼材溶液合并在一起，通過噴霧干燥或噴霧冷卻技術進行包裹，霧化后的液滴在氣流中干燥或冷卻固化，形成微囊。

二十世紀90年代是固體洗滌劑和液體洗滌劑市場競爭激烈的時期。寶潔公司公開了以洗滌助劑沸石為主要填充劑（3～97%），配合具有表面活性的成膜劑（0.1～25%）氧化胺聚合物﹑N-乙烯吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑聚合物或共聚物﹑馬來酸及丙烯酸聚合物或共聚物共混包埋制備的酶微囊顆粒的專利技術。利用此項專利技術制備酶微囊顆粒，不僅適合固體洗滌劑中添加，也是最早開發的適用于液體洗滌劑的微囊[18]。

針對液體洗滌劑和潮濕環境酶的穩定儲存問題，諾維信公司設計了一種高持水性微囊顆粒，其水溶性成分＞60%，包括pH＜11的堿金屬或堿土金屬的磷酸鹽﹑亞硫酸鹽﹑硫酸鹽﹑鹽酸鹽﹑碳酸鹽和碳原子數小于10的有機酸鹽。其制備工藝為，將含有酶的核心材料在流化床上流化，通過噴霧將含有水溶性化合物的液體介質引入流化床，使非揮發性化合物沉積在酶核心材料上形成固體包衣，同時除去液體介質。這種微囊充分利用了低分子水溶性化合物的填充效果和吸濕性質，既有利于保持高濕環境中酶的儲存穩定性，而且可以降低噴霧干燥的能耗[19]。

5.3 物理化學法

物理化學法微囊包載技術主要包括水相聚合法﹑油相聚合法﹑復相乳液法等。基于聚合物陰陽離子靜電作用將聚電解質沉積到酶顆粒上，形成聚電解質薄膜的水相聚合方法，是近來發展較快的微囊制備方法。寶潔公司以殼聚糖﹑四聚殼聚糖或其混合物為陽離子聚合物，海藻酸鹽（甘露糖醛酸單元（M）∶古羅糖醛酸單元（G）＝1.5∶1～4∶1）為陰離子聚合物，開發了可包載酶等多種生物活性物的功能性微囊[20]。制備此微囊時，將殼聚糖陽離子胺基與海藻酸陰離子通過正負電荷吸引形成復合物，溶解度降低，自體系中凝聚形成聚電解質半透膜。其顯著優點是，制備過程溫和﹑快捷﹑微囊化的酶活性損失小。這種生物材質微囊的刺激性小，具有良好的生物降解性，不僅適用于液體洗滌劑，還被開發用于洗護發產品的活性物添加[16]。

6．應用前景展望

中國洗滌用品工業“十二五”規劃綱要中提出了加快產品結構調整的基本思路，明確要求“加強酶制劑在洗滌劑中的應用研究，促進加酶洗滌劑產品的發展，研究用生物酶取代部分化學品從而減少化學品的使用和排放”。在西歐﹑日本和美國等發達國家，加酶洗滌劑占洗滌劑市場的80%～95%，在國內加酶洗滌劑所占比例為60%左右。可見，酶制劑在我國洗滌用品中的應用具有廣闊的增長空間。

采用合理的技術方法突破酶的穩定性限制瓶頸，提高洗滌劑的性價比，是我國洗滌用品工業需要面對的挑戰。筆者認為，在現有技術的基礎上，洗滌劑行業還應在以下四方面加大投入，以取得自主創新的知識產權，提升行業競爭力：

1）蛋白質工程技術和化學修飾仍是酶制劑穩定化的基礎，其有效結合將提供更具有商業價值的酶制劑穩定化技術方案，如在獲悉酶結構﹑功能和理化性質等信息的前提下，通過定向進化方法和定點的化學修飾結合，開發“雜合型酶”是酶穩定化技術的新熱點；

2）開發新型載體材料是酶微囊包載技術的研究重點，今后還要在尋找原料易得﹑價廉﹑生物降解性好﹑低刺激性或者適用范圍廣的材料上尋求微囊技術廣泛應用的突破口；

3）針對液體洗滌劑的酶穩定性改造技術將更加受到關注，穩定劑添加技術的應用還不能突破洗滌劑含水量和表面活性劑類型的限制，若與微囊包載技術﹑化學修飾技術適度整合，則可能更有效地克服其局限性；

4）配方師不僅要以酶制劑在洗滌劑中的半衰期作為考察指標，而且要以洗滌效果為重要參考，根據使用條件和成本選擇適宜的穩定性技術，對加酶配方進行具體優化，以開發更高效的加酶液洗滌劑。

[1] 岳霄(譯).洗滌劑酶的研究及展望[J].中國洗滌用品工業,2004,3:75-77.

[2] 羅林波,李健玲.影響液體洗滌劑中酶穩定性的研究[J].日用化學品科學,2010,33(6):27-29.

[3] Sierkstra L N,Klugkist J,Markvardsen P,et al.Protease variants and compositions[P].US 20110230386 A1,2011-09-22.

[4] Acevedo J,Rodriguez V,Saavedra M,et al.Cloning,expression and decoding of the cold-adaptation of a newwidely represented thermolabile subtilisin--like protease[J].Journal of Applied Microbiology,2013,114(2):352-363 .

[5] Strausberg S L,Ruan B,Fisher K E,et al.Directed coevolution of stability and catalytic activity in calcium-free subtilisin[J].Biochemistry,2005,44:3272-3279.

[6] Li Z,Roccatano D,Lorenz M,et al.Directed evolution of Subtilisin into a highly active and guanidiniumchloride-and sodiumdodecylsulfate--tolerant protease[J].ChemBio Chem,2012,13:691-699.

[7] Martinez R,Jakob F,Tu R,et al.Increasing activity and thermal resistance of bacillus gibsonii alkaline protease (BgAP) by directed evolution[J].Biotechnology and Bioengineering,2013,110(3):711-720.

[8] 徐金庫,張媛媛,劉均洪.酶穩定性的研究進展[J].化學與生物工程,2004,3:1-3.

[9] Schroeder M,Lenting H B M,Kandelbauer A,et al.Restricting detergent protease action to surface of protein fibres by chemical modification[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2006,72:738-744.

[10] Nielsen L K,Deane-wray A.4-substitutedphenyl-boronic acids as enzyme stabilizers[P].EP 0832174 B1,2002-05-08.

[11] ELLIOTT R,Phillip,WEISGERBER D,John,SAUNDERS C,Winston.Topical compositions containing enzymes stabilized with inhibitors[P].WO 03041680,2003-05-22.

[12] Nielsen L K,Simonsen O,Werntoft K,et al.Stabilized subtilisin composition[P].US 8071345,2011-12-06.

[13] Kasturi C,Wandstrat ME,Song B X.Liquid detergent composition exhibiting enhanced α-amylase enzyme stability[P].US 7579310,2009-08-25.

[14] Lenoir P M.Enzyme stabilization[P].US 8110539,2012-02-07.

[15] 王培祥,劉云,王濤,等.微膠囊技術在洗滌劑中的應用[J].日用化學工業,2006,36(4):239-242,250.

[16] 李世忠,劉慧珍.包載技術及其在化妝品中的應用[J].中國洗滌用品工業,2010,4:63-66.

[17] Callisen T H.Encapsulation of compounds in vesicles[P].EP 1358308B1,2010-01-20.

[18] Wilkinson C P D.BelgiumB.Enzyme granulates[P].US 5783547,1998- 07- 2 1

[19] 馬庫森 E K.一種新的改進的含酶顆粒[P].中國,ZL 99809429.3,2005-03-09.

[20] Boutique J P,Broeckx WA M,Stonehouse J R,et al.Microcapsules[P].US 7960330,2011-06-14.