灰樹花發酵液對小鼠抗疲勞作用的實驗研究

王金菊，黃 劍，李 超，王艷萍*

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457）

灰樹花（Grifola frondasa）又名貝葉多孔菌（polyporus frondosus）。其外觀灰白色，如卷心菜大，風味獨特，是近年來開發的珍奇食藥兩用菌之一[1]。灰樹花的多種營養素居各種食用菌之首[2]，灰樹花具有極高的醫療保健功能。從20世紀80年代開始，國內外學者對其進行了大量研究，從灰樹花子實體和菌絲體中提取了幾十種活性多糖[3-4]。經過大量的化學和藥理藥效研究證明，灰樹花發酵液中的活性多糖具有明顯的抗腫瘤[5]、抗HIV病毒[6]、改善免疫系統[7]、降血脂[8]、降血糖和降膽固醇[9-10]等生物活性，而其抗疲勞的效果鮮見文獻報道。

運動耐力實驗和生化指標的測定是評價疲勞的2個主要方法，負重游泳實驗是運動耐力實驗的方法之一，游泳時間的長短可以反應動物運動疲勞的程度[11]。在生化指標的評價中，血清尿素氮（SUN）的含量主要反映機體內蛋白質的代謝情況，機體在長時間運動后就會開始消耗體內蛋白質，從而產生大量的SUN，機體對運動負荷的適應性越低，形成的尿素越多；反之，機體運動后SUN含量越低，表明機體對運動負荷的適應能力強，疲勞的產生就會得到延緩。乳酸脫氫酶（LDH）可以氧化機體血液中的乳酸，從而降低血液中乳酸的含量，使機體回復正常的pH值水平，故LDH活性的增強可以大大加速血液乳酸的清除速率，進而提高機體的抗疲勞能力[12-13]。本研究通過小鼠負重游泳實驗、SUN、LDH指標的測定及跑籠實驗探究灰樹花發酵液的抗疲勞活性，為灰樹花發酵液在功能性食品中的應用提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

灰樹花菌株（Grifola frondosa）由本實驗室保存。

1.1.2 實驗動物

昆明種小鼠60只，雄性，體質量（20±2）g，中國人民解放軍軍事醫學科學院動物中心提供；許可證號：SCXK-（軍）2010-025。動物飼養在天津科技大學清潔級動物實驗房完成（環境設施合格證號：SYXK（津）2006-0005）。

1.1.3 試劑與主要儀器

乳酸脫氫酶試劑盒、尿素氮試劑盒均為南京建成生物工程研究所產品；DELTA-320型pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；回轉式恒溫調速搖瓶柜：上海欣蕊自動化設備有限公司；7L氣升式發酵罐（上海保興7L）：上海保興公司；SM-510型全自動滅菌鍋：日本YAMATO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 灰樹花發酵液的制備

發酵培養基為葡萄糖22g/L，蛋白胨3g/L，KH2PO40.8g/L；MgSO41.2g/L，115℃高壓滅菌30min，將種子發酵液按10%（v/v）接種量接種于發酵培養基中，25℃、140r/min發酵培養14d，抽濾去除菌體，得到灰樹花發酵液。將發酵液進行旋蒸，濃縮至固形物含量為4%（w/v）和8%（w/v），分別作為動物實驗的低濃度組和高濃度組待試樣品。

1.2.2 動物分組與給藥

將小鼠隨機分為空白組、灰樹花發酵液低濃度和高濃度組，每組各12只。樣品組分別灌喂0.2mL低濃度和高濃度的發酵液，空白組灌喂相同體積的生理鹽水，連續灌喂25d，小鼠正常的飲食和攝水，25d后測定小鼠的體質量。

1.2.3 負重游泳實驗

每組選用6只小鼠，末次給予小鼠受試物30min后，置小鼠于游泳箱中游泳，水深為35cm，水溫為（25.0±0.5）℃，鼠尾根部負荷5%（w/w）體質量的鉛皮。記錄小鼠從游泳開始至力竭的時間，作為小鼠游泳力竭時間。

力竭標準：小鼠沉入水面以下8s，無法上浮。

1.2.4 血尿素氮（BUN）和乳酸脫氫酶（LHD）的測定

每組選用6只小鼠，末次給予小鼠受試物30min后，在溫度為（30±0.5）℃的水中不負重游泳90min，休息60min后，采血清0.5mL，依照BUN和LHD試劑盒說明書操作。

1.2.5 灰樹花發酵液與同類產品的抗疲勞效果比較

將小鼠隨機分為空白組、發酵組、佳得樂組（陽性對照）和紅牛組（陽性對照），每組各12只。發酵液組灌喂0.2mL發酵液（濃縮至固形物含量為8%），其他各組分別灌以相同體積的生理鹽水、佳得樂和紅牛，每天灌胃1次，連續25d后測定小鼠體質量、負重游泳試驗、BUN和LHD含量，具體測定方法參考1.2.3和1.2.4。

1.2.6 跑籠實驗研究抗疲勞效果

將小鼠隨機分為空白組、發酵液組、佳得樂組（陽性對照）和紅牛組（陽性對照），每組各6只。發酵液組灌胃0.2mL發酵液（濃縮至固形物含量為8%（w/v）），其他各組分別灌以相同體積的生理鹽水、佳得樂和紅牛，每天灌喂1次，連續25d后，將跑鼠籠置于水槽內使其1/3浸沒于水面之下，并使水溫控制在（15±2）℃。經過預實驗設定小鼠的疲勞閾值為跑籠速度2r/min，當小鼠運動速度低于閾值時，認為其處于疲勞狀態。小鼠灌胃后8min跑籠，測定其跑籠速度和跑籠時間。因飲料功效不同，跑籠速度快，持續時間長，可認為該飲料對疲勞小鼠體力恢復的效果好。

1.2.7 數據統計學處理

2 結果與分析

2.1 不同濃度發酵液對小鼠抗疲勞能力的影響

2.1.1 灰樹花發酵液對小鼠體質量的影響

表1 灰樹花發酵液對小鼠體質量的影響(±s,n=12)Table 1 Effect of broth on body weight of mice(±s,n=12)

表1 灰樹花發酵液對小鼠體質量的影響(±s,n=12)Table 1 Effect of broth on body weight of mice(±s,n=12)

注：與空白組相比較，“*”表示p＞0.05。

表1顯示，3組小鼠灌喂25d后體質量均有增加，但與空白對照組比較，低濃度組和高濃度組在體質量上無顯著性差異。表明灰樹花發酵液對小鼠體質量增長無顯著影響。

2.1.2 對負重游泳力竭時間、BUN及LHD的影響

表2 發酵液對小鼠負重游泳力竭時間、BUN和LHD的影響（±s,n=6）Table 2 Effect of broth on exhausted time of mice in swimming,BUN and LHD（±s,n=6）

表2 發酵液對小鼠負重游泳力竭時間、BUN和LHD的影響（±s,n=6）Table 2 Effect of broth on exhausted time of mice in swimming,BUN and LHD（±s,n=6）

注：與空白組相比較，“*”表示p＜0.05。

從表2可以看出，對于游泳力竭時間，t(高濃度組)＞t(低濃度組)＞t(空白組)，與空白組相比，高濃度組有顯著性差異，但低濃度組與空白組相比沒有顯著性差異。無論從各組的均值還是顯著性差異來看，高濃度的灰樹花發酵液是有助于延長力竭游泳時間。

通過BUN濃度的比較可以發現，C(高濃度組)＜C(空白組)＜C(低濃度組)，與空白組相比，高濃度組BUN濃度具有顯著性差異（p＜0.05）；但低濃度組與空白對照組之間沒有顯著性差異（p＞0.05），這說明高濃度的灰樹花發酵液是有助于緩解蛋白質與氨基酸分解代謝，增強了對負荷的適應性。此外，對于各組小鼠的LHD活力，U(低濃度)＞U(高濃度)＞U(空白組)，低濃度組和高濃度組的LHD活力都很高；與空白組相比，高濃度組和低濃度組都具有顯著性差異（p＜0.05），但是高濃度組和低濃度組之間無顯著性差異，也就是說，說明灰樹花發酵液有助于減少運動后乳酸在肌肉中的堆積，提高小鼠對負荷的適應性，從而緩解疲勞狀態。

2.2 發酵液與同類產品的抗疲勞效果比較

2.2.1 各樣品對小鼠體質量的影響

表3 發酵液、佳得樂和紅牛對小鼠體質量的影響(±s,n=12)Table 3 Effect of broth,Gatorade and Red Bull on body weight of mice (±s,n=12)

表3 發酵液、佳得樂和紅牛對小鼠體質量的影響(±s,n=12)Table 3 Effect of broth,Gatorade and Red Bull on body weight of mice (±s,n=12)

注：與空白組相比較，“*”表示p＜0.05。

由表3可以看出，4組小鼠給藥25d后體質量均有增加，與空白組相比，發酵液組和陽性組都無顯著性差異，表明發酵液組、佳得樂和紅牛對體質量無顯著影響（p＞0.05）。

2.2.2 對負重游泳力竭時間、BUN及LHD的影響

表4 發酵液、佳得樂和紅牛對小鼠負重游泳時間、BUN和LHD的影響（±s,n=6）Table 4 Effect of broth,Gatorade and Red Bull on exhausted time in swimming,BUN and LHD（±s,n=6）

表4 發酵液、佳得樂和紅牛對小鼠負重游泳時間、BUN和LHD的影響（±s,n=6）Table 4 Effect of broth,Gatorade and Red Bull on exhausted time in swimming,BUN and LHD（±s,n=6）

由表4可以看出，對于各組小鼠的力竭游泳時間，t(紅牛組)＞t(發酵液組)＞t(空白組)＞t(佳得樂)，與空白組和佳得樂組相比，發酵液組和紅牛組都具有極顯著性差異（p＜0.01），雖然發酵液組與紅牛組相比游泳時間更長，但兩組之間并無顯著性差異。

通過BUN濃度的比較可以發現，C(發酵液組)＜C(佳得樂)＜C(紅牛組)＜C(空白組)，與空白組相比，發酵液組、佳得樂組和紅牛組都具有顯著性差異（p＜0.05），但是該3組之間并無顯著性差異。綜上所述，灰樹花發酵液具有同佳得樂和紅牛相似的抗疲勞效果，但是該指標結果不能證明發酵液比同類產品要更好。

此外，對于各組小鼠的LHD活力，U(發酵液組)＞U(佳得樂)＞U(紅牛組)＞U(空白組)，即發酵液組的LDH活力均值最高，但各組之間無無顯著性差異（p＞0.05）。究其原因，可能是組內差異要大于組間差異，即組內所測得的LDH活力差異性過大。造成這種現象的可能原因是在實驗過程中，由于冬季氣溫較低，少數對溫度敏感的小鼠，提早出現疲勞和力竭狀態；而相對耐寒的小鼠則更容易適應本次實驗，這樣最終造成了組內的差異遠超過組間的差異，進而無法通過方差分析得出組間的顯著性差異。

2.3 跑籠實驗結果

2.3.1 對小鼠跑籠時間和速度的影響

表5 發酵液、佳得樂和紅牛對小鼠跑籠時間和速度的影響（±s,n=6）Table 5 Effect of broth,Gatorade and Red Bull on time and speed of mice(±s,n=6)

表5 發酵液、佳得樂和紅牛對小鼠跑籠時間和速度的影響（±s,n=6）Table 5 Effect of broth,Gatorade and Red Bull on time and speed of mice(±s,n=6)

注：與空白組相比較，“*”表示p＜0.05。

由表5可以看出，對于跑籠事件t(發酵液組)＞t(佳得樂組)＞t(紅牛組)＞t(空白組)，即發酵液組小鼠在冷水中跑籠時間最長。與空白組相比，發酵液組存在顯著性差異；但是與陽性對照組（佳得樂和紅牛組）相比，則無顯著性差異。

通過對各組小鼠跑籠速度的分析可以看出，雖然V(發酵液組)＞V(佳得樂組)＞V(紅牛組)＞V(空白組)，但各組之間并無顯著性差異。這可能是由于組內差異大于組間差異[14]所造成的，即組內差異性遠大于組間差異性，從進而各組之間的差異不存在顯著性。

2.3.2 對小鼠每分鐘內跑籠圈數的對比分析

表6 各組小鼠每分鐘內跑籠圈數（圈）隨時間的變化Table 6 Change of the lap number per minute with time

由表6和附圖可知，發酵液組小鼠在整個跑籠過程中，跑籠時間最長而且整體速度比其他3組更快，并且在較短時間內達速度峰值（第4min時達最大速度6.30r/min），這間接的反應了實驗組能小鼠能快速適應強度較大的運動。而佳得樂組小鼠跑籠速度和紅牛組小鼠在整體水平上較為接近，跑籠時間也僅僅比紅牛組多1min。從總體趨勢來看，空白組和佳得樂組的跑籠速度上下波動較大，可能是由于個體差異性太大引起的，個別小鼠能快速適應低水溫，有的則不然。

圖1 各組小鼠每分鐘內跑籠圈數隨時間的變化Fig.1 Change of the lap number per minute with time

3 結論

（1）與陽性對照組相比較，灰樹花發酵液（濃縮至固形物含量為8%（w/w））具有相似的抗疲勞效果。

（2）與空白組相比較，灰樹花發酵液在提高體能，緩解疲勞方面具有顯著性的效果，具有開發成為抗疲勞食品的潛力。

[1]韓省華，林勝龍，張東平.灰樹花在百山祖山區的發生及其規律[J].江蘇食用菌，1994，15（2）：35.

[2]王增池，孔德平，田曉亮.灰樹花的生態條件與藥用價值[J].中國食用菌，1998，17（6）：39-40.

[3]SUZUKI N,NISHIBORI K,OODAIRA Y,et al.Grifolisin，a member of the sedolisin family produced by the fungusGrifola frondosa[J].Phytochemistry,2005,66(9):983-990.

[4]OHNO N,SUZUKI I,OIKAWA S,et al.Antitumor activity and structural characterization of glucans extracted from cultured fruit bodies ofGrifola frondosa[J].Chem Pharm Bull,1984,32(6):1142-1151.

[5]候曉青，程桂芝.灰樹花多糖抗腫瘤小鼠S180 肉瘤的實驗研究[J].中國藥房，2007，18（3）：180-181.

[6]NANBA H,KODAMA N,SCHAR D,et al.Effect of Maitake (Grifola frondosa)glucan in HIV-infected patients[J].Mycoscience,2000,41(4):293-295.

[7]MASUDA Y,KODAMA N,NANBA H.Macrophage J774.1 cell is activated by MZ-Fraction (Klasma-MZ) polysaccharide inGrifola frondosa[J].Mycoscience,2006,47(6):360-366.

[8]袁德云，章克昌.灰樹花發酵液及其胞內純化物的降血脂作用[J].中國藥學雜志，2003，38（57）：507-508.

[9]KUBO K,AOKI H,NANBA H.Anti-diabetic activity present in the fruit body ofGrifola frondosa[J].Biol Pharm Bull,1994,17(8):1106-1110.

[10]KUBO K,NANBA H.Anti-hyperliposis effect of Maitake fruit body(Grifola frondosa)[J].Biol Pharm Bull,1997,20(7):781-785.

[11]林新堅，鄭永標，陳濟琛，等.靈芝發酵茶提取液對小鼠抗疲勞作用的研究[J].食用菌學報，2002，9（3）：18-21.

[12]郅 潔，李炳奇，廉宜君，等.沙棗多糖的提取及其抗氧化活性的研究[J].中成藥，2009，31（5）：796-798.

[13]HUANG LZ,HUANG BK,YE Q,et al.Bioactivity-guided fractionation for anti-fatigue fortune ofAcanthopanax senticosus[J].J Ethnopharmacol,2011,133(1):213-219.

[14]劉振學，黃仁和，田愛民.實驗設計與數據處理[M].北京：化學工業出版社，2005.