槲皮素與針刺聯(lián)用對缺血再灌注損傷大鼠的影響

宋 林，張 麗，許 康

(湖北省新華醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，武漢 430015)

腦卒中是老年人的常見疾病，具有高發(fā)病率、高病死率以及高致殘率的特點，嚴重危害人類健康,給社會和家庭造成了沉重的精神和經(jīng)濟負擔(dān)。缺血性腦卒中約占全部卒中的75%左右，對其治療主要集中在促進卒中后神經(jīng)系統(tǒng)功能的恢復(fù)、改善腦部循環(huán)、抗氧化自由基損傷、抗興奮性氨基酸等方面[1-2]。槲皮素是中藥中廣泛存在的黃酮類化合物，研究[3]證實其具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抗腫瘤等功效。傳統(tǒng)中醫(yī)針刺治療也被認為能夠很好的改善腦血管再通(即再灌注)造成的腦神經(jīng)損傷。本試驗研究目的旨在探討槲皮素與針刺療法聯(lián)用在體內(nèi)對腦缺血再灌注損傷的保護作用及抗炎機制，從而為臨床更好的進行腦保護治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康SD雄性大鼠100只，體質(zhì)量(200±20) g，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。槲皮素購自sigma公司；水合氯醛購自上海試劑一廠;考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒、谷胱甘肽試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒、丙二醛試劑盒、總抗氧化能力試劑盒等均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 動物分組與干預(yù) 100只大鼠隨機均分成5組，每組20只，分別為假手術(shù)組、模型組、槲皮素干預(yù)組、針刺干預(yù)組、槲皮素針刺聯(lián)合干預(yù)組。假手術(shù)組除不進行栓線外，其余處理皆與模型組相同。槲皮素干預(yù)于實驗前3 d開始灌胃給藥,1次/d，造模前1 h再次灌胃給藥，每次給藥劑量均為100 mg/kg。電針干預(yù)依據(jù)《大鼠穴位圖譜的研制》[4]及《實驗針灸學(xué)》進行選穴，分別選擇人中穴(也稱水溝穴，位于大鼠唇裂鼻尖下1 mm正中處，直或向上刺1 mm)、中沖穴(雙側(cè)，中指末節(jié)尖端中央，直刺1 mm，選穴依據(jù)1999年9月第1版《實驗針灸學(xué)》附常用實驗動物的針灸穴位)及風(fēng)府穴(也稱天門穴，位于大鼠枕骨頂嵴后枕寰關(guān)節(jié)背凹陷處，向后下方斜刺1 mm進針)。針刺組動物在造模后1 h通以電針治療儀(G6805型，疏密波)，頻率為2 Hz，刺激強度為2 mA,以大鼠肢體或針柄微微顫動為度，每次持續(xù)時間20 min。

1.3 動物模型的建立 參照Zea Longa等[5]方法并稍加改良建立大鼠中動脈栓塞缺血/再灌注損傷模型，使用10%的水合氯醛4 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，頸部正中切口，分離出頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)及頸內(nèi)動脈(ICA)。結(jié)扎右側(cè)CCA的近心端、ECA及其分支動脈。沿ICA向下分離翼顎動脈，根部結(jié)扎該分支。在ICA近端備線，遠端放置動脈夾，CCA分叉處切口，插入直徑約0.22 mm的尼龍線(深度約為17～20 mm)，尼龍線沿ICA入顱至大腦前動脈，阻斷大腦中動脈所有血流來源。缺血1 h后，緩慢拉出尼龍線再灌注。

1.4 神經(jīng)功能評分 存活鼠在灌注24 h后，參照Zea Longa等[5]標(biāo)準(zhǔn)進行神經(jīng)功能評分。0分：正常，無任何神經(jīng)損傷癥狀及功能缺陷；1分：不能完全伸展對側(cè)前爪；2分：向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向?qū)?cè)傾倒；4分：不能行走，意識喪失。行為評分結(jié)束后，快速斷頭并于冰上分離患側(cè)腦組織，取皮質(zhì)100 mg，制成5%的組織勻漿。同時取新鮮血液5 mL，使用離心機以3 000 r/min,離心10 min，分離血漿，置于-80 ℃冰箱保存，待測。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素與針刺聯(lián)用對缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能的影響 見表1。

表1 槲皮素與針刺聯(lián)用對缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能的影響(±s,n=20)

2.2 槲皮素與針刺聯(lián)用對缺血再灌注大鼠腦組織抗氧化水平的影響 見表2。

表2 槲皮素與針刺聯(lián)用對缺血再灌注大鼠腦組織抗氧化水平的影響(±s,n=20)

3 討論

中醫(yī)學(xué)認為，缺血性腦卒中乃氣血逆亂，產(chǎn)生風(fēng)、火、痰、瘀，進而導(dǎo)致腦脈痹阻所致。多年來的實踐經(jīng)驗[6]認為，缺血性腦血管病的栓塞期給予及時有效的針刺治療能夠很好的改善腦血管再通(即再灌注)造成的損傷，降低本病的致死率和致殘率。研究[7]提示，針刺對腦缺血再灌注所致的自由基損傷有明顯的改善作用，提示針刺可以通過改善氧化應(yīng)激損傷發(fā)揮神經(jīng)元保護作用[8]。中醫(yī)治療腦卒中的關(guān)鍵是“竅閉神匿，神不導(dǎo)氣”，本實驗選用的人中、中沖、風(fēng)府3穴共奏醒腦開竅、健腦補髓、疏風(fēng)通絡(luò)的功效。

槲皮素具有超強抗氧化及清除自由基的作用，同時還被證實[9]具有抗癌、抗感染、抗病毒、降糖、降壓、免疫調(diào)節(jié)及心血管保護作用等多種生物學(xué)功效。有研究[10]提示其可能通過抑制海馬錐體神經(jīng)元的外向鉀電流進而對谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷起保護作用，從而提示槲皮素對缺血樣損傷的神經(jīng)具有保護作用。

本研究結(jié)果表明，槲皮素與針刺聯(lián)用能夠有效改善腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)損傷，提高腦組織抗氧化系統(tǒng)的能力，減少脂質(zhì)過氧化損傷，對腦神經(jīng)具有良好的保護作用。從而提示選用藥物與物理治療相結(jié)合的方式治療缺血性腦卒中與單一治療方式相比具有更好的療效。此研究將為缺血性腦卒中的臨床治療提供一定的實驗數(shù)據(jù)及理論基礎(chǔ)。

[1]Jacquin A,Hervieu-Begue M,Daubail B,et al.J[J].Rev Prat,2012,62(9):1221-1224.

[2]Romero JR,Wolf PA.Epidemiology of stroke: legacy of the framingham heart study[J].Global heart,2013,8(1):67-75.

[3]Okamoto T.Safety of quercetin for clinical application (Review)[J].Int J Mol Med,2005,16(2):275-278.

[4]周浩良.大鼠穴位圖譜的研制[Z],1991.

[5]Longa Zed,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[6]陳妹,王恩龍.針刺治療缺血性腦中風(fēng)50例[J].實用中醫(yī)內(nèi)科雜志,2012(4):72-73.

[7]霍則軍,張莉,錢瑞琴.針刺不同穴組對全腦缺血再灌注大鼠TNF-α、IL-6、WBC和自由基的影響[J].針刺研究,2003,28(2):94-98.

[8]傅立新,石學(xué)敏,李平.針刺對腦缺血及再灌注家兔腦水腫、自由基病理學(xué)損傷的保護作用及相關(guān)性分析[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2000,6(2):52.

[9]孫涓,余世春.槲皮素的研究進展[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐,2011(3):85-88.

[10]Annapurna A,Ansari MA,Manjunath PM.Partial role of multiple pathways in infarct size limiting effect of quercetin and rutin against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2013,17(4):491-500.