安絡小皮傘菌糖肽理化性質與鎮痛作用

高 陽,楊獻玲,徐多多

(1.長春中醫藥大學研發中心,長春 130117;2.吉林省食品藥品檢驗所,長春 130021)

安絡小皮傘(Marasmius and rosaceus)俗稱鬼毛針，是一種真菌，屬擔子菌綱、傘菌目、白蘑科小皮傘屬。也是一種用于治療多種疼痛的中藥,商品名稱為安絡痛。研究[1-3]表明，其鎮痛作用為有機酸和甾醇類化合物[1-3]。筆者對其有效部位進行了篩選，發現其水提醇沉淀物具有長時效鎮痛作用，并對該有效部位進行分離、純化，通過甲基化等方法，研究其理化性質和化學結構，確定其鎮痛作用的物質基礎，為安絡小皮傘菌的進一步開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 安絡小皮傘菌絲體發酵物由吉林省新華藥業提供。DEAE-Sephadex A-50，Sephadex G-100，標準單糖Fuc(巖藻糖)、Rha(鼠李糖)、Ara(阿拉伯糖)、Xyl(木糖)、Man(甘露糖)、Gal(半乳糖)、Glu(葡萄糖)、葡萄糖醛酸(GlcA)、牛血清蛋白均為Sigma公司產品。其余試劑均為國產分析純。蛋白質測定用試劑甲、乙為本實驗室配制。大孔吸附樹脂D101為天津大學生產。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備 安絡小皮傘菌絲體發酵物加5倍量水溶解，離心，重復此操作4次,殘渣干燥(R)，上清液合并，濃縮至小體積，加95%乙醇至醇濃度達到80%，靜止過夜，離心,沉淀冷凍干燥(樣品P)，上清液回收乙醇，得到醇溶性小分子部分(S)。

1.2.2 理化性質的分析 樣品總糖、蛋白質、糖醛酸含量測定分別以葡萄糖為標準品,以苯酚硫酸法測定總糖含量[4]；以牛血清白蛋白為標準品，用Lowry法測定蛋白質含量[5]；以葡萄糖醛酸為標準品，間羥基聯苯法測定糖醛酸含量[6]。分子量分布采用高效液相色譜法進行測定[4]。

1.2.3 對醋酸導致小鼠扭體的抑制作用實驗 昆明種小鼠(清潔級)，購自吉林大學,合格證號為SCXK(吉)2008-0005，體質量18～22 g，雌雄兼用，隨機分組。樣品以水溶解后各組小鼠每天灌胃給藥1次，模型對照組給與等體積的水，連續10 d，正常進食。末次給藥1 h后，每只小鼠腹腔注射0.6%的醋酸，觀察小鼠20 min內的扭體次數。

1.2.4 大孔樹脂柱層析 樣品P以水溶解，離心后上樣，分別以水(D1)、30%乙醇(D2)、60%乙醇(D3)、95%乙醇(D4)洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，濃縮后分別冷凍干燥得到D1、2、3、4等4個部分。

1.2.5 D2部分的純化 樣品D2 200 mg，以水溶解后在Sephadex G-100凝膠色譜柱(60 cm×4 cm)進行柱層析。每6 mL為1個流分收集洗脫液，測定其中的糖(酚-硫酸法)和蛋白質(UV 280 nm)含量，對洗脫流份作圖，根據洗脫曲線合并12-25管(D2H)和26-58管(D2L)，凍干，得到純化糖肽。

1.2.6 純化樣品的結構分析[8]采用Hakomori法(箱守法)，利用GC-MS檢測：HP-5石英毛細管柱為30 mm×0.25 mm，進樣口溫度250 ℃。柱溫120 ℃保持5 min，5 ℃/min升到220 ℃，在220 ℃保持20 min。進樣量為0.2 μL。采用美國FINGAN公司的Xcalibur數據處理系統。紅外光譜在Spectrum紅外光譜儀測定。

2 結果

2.1 糖蛋白部分的提取和性質分析 安絡小皮傘菌絲體粗糖肽中的糖部分是由葡萄糖和甘露糖組成,摩爾比為1∶9.2。氨基酸分析結果表明，其中含有10種氨基酸(在樣品中的百分含量)Glu(6.12%)，Asp(10.10%)，Hyp(2.19%)，Ser(3.46%)，Arg(2.01%)，Gly(3.02%)，Thr(0.30%)，Pro(1.33%)，Leu(2.21%)and Lys(0.67%)。

2.2 糖蛋白的分離和理化性質分析 見表1。

表1 不同糖蛋白理化性質分析結果

2.3 對醋酸導致小鼠扭體的抑制作用實驗 見表2。

2.4 糖蛋白的純化和糖苷鍵分析 見表3。

表2 各樣品對乙酸導致小鼠扭體反應的影響(n=10)

表3 D2H和D2L中糖苷鍵連接方式

3 討論

鎮痛實驗結果表明，安絡小皮傘菌絲體中分離得到的糖蛋白類成分具有鎮痛作用，該部分含量占菌絲體的20%以上，是其鎮痛作用的藥效物質基礎。分離得到的樣品P為組成復雜的糖蛋白，經過大孔樹脂分離后，得到的各樣品糖和肽的含量有所不同，組成糖相同但其摩爾比例不同；表明安絡小皮傘糖肽中多種糖肽具有鎮痛作用；通過凝膠柱層析分離得到的純化糖肽-D2H和D2L具有明顯的鎮痛作用，進而證明糖肽類成分是安絡小皮傘鎮痛作用的有效成分。對純化糖肽的糖部分進行的分析表明，該糖蛋白中糖的部分無論分子量大小，均是由1-4連接Glc為主鏈,在其6位連接由Glc、Man和Gal構成的側鏈；肽部分是由10種氨基酸組成；該鎮痛作用可能來自這些糖肽均具有的共性結構部分。

[1]戴芳瀾.中國真菌總匯[M].北京:科學出版社,1979:532-534.

[2]方圣鼎,張振德,陳嫌,等.安絡小皮傘中的鎮痛成分[J].中草藥,1989,20(10):2-4.

[3]陳西廣,張翼伸.安絡小皮傘中水溶性多糖的研究[J].真菌學報,1990(2):155-160.

[4]張惟杰.糖復合物生化研究技術[M].2版.杭州:浙江大學出版社,2003:1-259.

[5]李建武,蕭能庚,余瑞元.生物化學實驗原理方法[M].北京:北京大學出版社,1994.