安絡(luò)小皮傘鎮(zhèn)痛作用糖蛋白純化方法研究

高 陽，楊獻(xiàn)玲，徐多多

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心,長(zhǎng)春 130117;2.吉林省食品藥品檢驗(yàn)所，長(zhǎng)春 130021)

安絡(luò)小皮傘(Marasmius androsaceus)俗稱鬼毛針，是一種真菌，屬擔(dān)子菌綱、傘菌目、白蘑科小皮傘屬。為進(jìn)一步了解安絡(luò)小皮傘糖蛋白的純化、制備方法[1]，筆者對(duì)其進(jìn)行不同方法的分離，結(jié)合對(duì)小鼠的醋酸扭體抑制實(shí)驗(yàn)，對(duì)各種分離方法的結(jié)果進(jìn)行了比較，為安絡(luò)小皮傘的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 材料 安絡(luò)小皮傘浸膏由吉林新華藥業(yè)提供。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖醛酸均為Sigma公司產(chǎn)品，純度為99%。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。試劑甲、試劑乙為本實(shí)驗(yàn)室配制。大孔吸附樹脂D101(國(guó)產(chǎn));DEAE-Sephadex A-50，為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 儀器 BSZ-100A自動(dòng)部分收集器；752紫外可見分光光度計(jì);Mettler-Toledo天平AB204-N(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；德國(guó)Christ Alphal-2型冷凍干燥機(jī)；氣相色譜為溫嶺福立分析儀器公司GC-9790及N-2000雙通道色譜工作站，1%OV-225不銹鋼填充柱(Φ2 mm×2 m)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 安絡(luò)小皮傘糖蛋白的制備 安絡(luò)小皮傘菌絲體發(fā)酵物加重蒸水熱水浴攪拌，離心，殘?jiān)鼦壢ィ喜⑸锨逡海瑵饪s，加乙醇至醇含量為80%,攪拌、靜置過夜、離心，醇沉部分干燥，加水溶解，離心，上清液冷凍干燥，得安絡(luò)小皮傘粗糖蛋白。

2.2 樣品的分離

2.2.1 DEAE-Sephadex A-50離子交換柱分離純化浸膏多糖 取樣品10 g以60 mL重蒸水溶解，離心后上樣，分別以蒸餾水0.2、0.4、.8 mol/L NaCl溶液洗脫，合并各部分洗脫液，濃縮，冷凍干燥，得到4部分樣品，收率依次為19%、10%、8%、0.3%(除蒸餾水洗脫部分外，其余各部分需經(jīng)透析后再冷凍干燥)。

2.2.2 大孔樹脂柱層析 取樣品50 g以500 mL重蒸水溶解，離心后上樣，分別以重蒸餾水、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇,濃縮后分別冷凍干燥得到4部分，收率依次為56.9%、19.2%、11.5%、0.1%。

2.3 樣品理化性質(zhì)的測(cè)定 樣品以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，苯酚硫酸法測(cè)定總糖含量[2]；以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[3]；以葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，間羥基聯(lián)苯法測(cè)定糖醛酸含量[4]。分子量分布采用高效液相色譜法進(jìn)行了測(cè)定，將樣品用0.7%硫酸鈉溶液溶解樣品配置成5 mg/mL，島津液相色譜系統(tǒng)：10AT-VP泵，示差折光檢測(cè)器，并采用GPC多糖專用軟件處理;單糖組成利用氣相色譜法對(duì)樣品的糖醇乙酸酯衍生物進(jìn)行分析[2]。

2.4 經(jīng)超濾分離樣品的分子量分布測(cè)定 采用高效液相色譜法對(duì)超濾分離的兩部分樣品分子量分布進(jìn)行測(cè)定，希望通過結(jié)合藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果了解分子量的不同對(duì)活性的影響。

2.5 不同分離方法分離得到的樣品鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)

2.5.1 藥品與儀器 樣品為本實(shí)驗(yàn)室按照前述方法制備。陽性藥為阿司匹林,醋酸。動(dòng)物：昆明種小鼠(清潔級(jí))，體質(zhì)量18～22 g，雌雄兼用，隨機(jī)分組，每組10只。

2.5.2 實(shí)驗(yàn)方法 小鼠禁食(自由進(jìn)水)24 h后,按照表中所述劑量，灌胃給予受試藥物連續(xù)10 d后，再腹腔注射0.6%醋酸0.2 mL/只，觀察記錄注射醋酸后20 min內(nèi)小鼠扭體次數(shù)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 不同方法分離得到的樣品理化性質(zhì)的測(cè)定 見表1。

表1 不同分離方法得到的樣品理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各部分樣品糖醛酸很低，主要是由糖和蛋白構(gòu)成的糖蛋白類物質(zhì)，其中糖蛋白部分中的糖主要由葡萄糖和甘露糖組成。

3.2 超濾樣品分子量分布的測(cè)定 濃縮液分子量23 018，為90%；超濾液分子量770，為54%。

3.3 鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn) 見表2～表4。

表2 不同分離部分對(duì)乙酸導(dǎo)致小鼠扭體反應(yīng)的影響(±s,n=10)

表2表明，不同洗脫部分均具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，鎮(zhèn)痛作用基本相同。

表3 D101樹脂柱分離各部分對(duì)乙酸導(dǎo)致小鼠扭體反應(yīng)的影響(±s,n=10)

表3表明，30%和60%乙醇洗脫部分均具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，水洗脫部分與醇洗脫部分相比活性較弱。

表4 濃縮液、超濾液對(duì)乙酸導(dǎo)致小鼠扭體反應(yīng)的影響(±s,n=10)

表4表明，超濾液和濃縮液均具有明顯的鎮(zhèn)痛作用。

4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)和利用安絡(luò)小皮傘奠定了一定的基礎(chǔ):1)3種方法均可對(duì)安絡(luò)小皮傘糖蛋白部分起到分離和純化的作用，通過離子交換柱層析的方法和通過超濾的方法均可將安絡(luò)小皮傘糖蛋白部分按照攜帶電荷的不同或分子量大小不同進(jìn)行分離。但是所得到的各個(gè)部分雖然攜帶電荷不同或分子量不同，但均具有相似的鎮(zhèn)痛作用。2)通過大孔樹脂柱層析的方法可將安絡(luò)小皮傘糖蛋白部分分離得到不同極性的部分，極性最大的水洗脫部分活性很弱，但極性較小的部分具有很高的活性，說明可通過該方法有效富集有效部分，使活性成分更加集中。水洗脫的部分糖蛋白極性大，但活性較弱，隨著極性的增加，安絡(luò)小皮傘糖蛋白鎮(zhèn)痛作用有所降低。3)在一定的范圍內(nèi)，糖的含量、蛋白的含量以及不同的分子量，對(duì)安絡(luò)小皮傘糖蛋白的鎮(zhèn)痛作用無明顯影響。表明多種糖蛋白均具有鎮(zhèn)痛作用。

[1]Isolation G Q,characterization of glycopeptides with analgesic activities from Marasmius androsaceus[M].Carbohydrate polymers,2012.

[2]張惟杰.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)[M].杭州:浙江大學(xué)出版社,1999:11-12,40.

[3]Li j w,Xiao N G,Yu R Y,et al.Theories and Methods of Biochemical Experiment[M].Beijing:peking university press,1994:160-176.

[4]Nelly B K,Gustar A H.New method for quantitative determination of uronc acid[J].Anal Biochem,1973(54):484-487.