海南特有安諾蘭DNA提取方法研究方法研究

任軍方 姜殿強 覃瓊瑤 云勇

摘 要：以安諾蘭為試驗材料，研究改良的CTAB法對安諾蘭不同部位（老葉、嫩葉、氣生根、花序、花苞）進行基因組DNA的提取，利用核酸蛋白測定儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量。結果表明，安諾蘭嫩葉的DNA提取從純度和提取率均優于其他部位；花苞次之；花序DNA提取有少量的雜質污染， 老葉有少量RNA殘留， 氣生根則質量低。

關鍵詞：安諾蘭；DNA提取；ISSR

中圖分類號 Q949.71+8.43 文獻標識碼 B 文章編號 1007-7731（2013）09-22-03

安諾蘭（Anota hainanensis RolfeSchltr），又名海南鉆喙蘭，是蘭科安諾蘭屬唯一的一個種，是海南特有種，為多年生常綠附生亞灌木狀草本植物，屬典型的熱帶附生蘭。產于海南中南部低海拔丘陵地區，其性喜高溫、通風、光照充足的氣候環境，耐干旱，畏濕，畏寒冷，春節前后開花，是春節期間頗受歡迎的賀歲應節蘭花品種。因具有很高的觀賞和藥用價值，其野生資源被掠奪性采伐，造成資源枯竭。目前對海南安諾蘭的研究主要在其栽培[1]和組織培養[2]等方面，尚未見報道有關海南安諾蘭種質資源收集、遺傳多樣性的研究。

ISSR（Inter Simple Sequence Repeat，簡單重復序列間擴增）是由Zietkiewicz等[3]人于1994年提出的一種新的分子標記技術，該技術具有快速、穩定性、多態性高、重復性好等優點[4]。ISSR標記通常為顯性標記[5]，具有很好的穩定性、多態性[6]，而且無需預知研究對象的基因組序列而設計特異引物，操作簡單，因此該技術已廣泛應用于品種鑒定[7]、基因定位及遺傳多樣性分析中[8-9]。高質量的總DNA及穩定的PCR反應體系是獲取可靠分子標記結果的前提[10]，為此，筆者擬研究獲得高質量安諾蘭基因組DNA的提取方法，并建立安諾蘭ISSR反應體系，為該分子標記技術在海南安諾蘭種質資源研究和遺傳育種中的應用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試材料來自于海南省農業科學院園林花卉研究所蘭圃的安諾蘭，選取安諾蘭不同部位—老葉、嫩葉、氣生根、花序、花苞為材料。

1.2 DNA提取方法優化 經過改良的CTAB提取方法：（1）取材料1g加少量的PVP，在液氮中研磨至白色粉末狀，將粉末迅速轉入2.0mL的離心管中，放入冰盒備用。（2）每份樣品加入1.5mL 60℃預熱的DNA提取緩沖液，輕輕搖勻，放在冰上。（3）等所有提樣品都研磨完以后，12 000rpm，4℃，離心5min，丟棄上清液。（4）加入約750mL預熱60℃的裂解緩沖液，充分搖勻，65℃水浴45min，每隔20min搖1次，使其充分混勻。（5）加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1）提取液搖勻至白色乳濁狀，用10 000rpm，25℃，離心20min；將上清液轉入新的2mL離心管中。（6）加入1/10體積3M乙酸鈉（pH5.2）和0.6倍體積的預冷異丙醇，緩慢搖勻至有絮狀沉淀物析出，常溫下靜置至少1h。（7）用6 000rpm，25℃，離心15min，倒掉上部液體，用75%乙醇洗3次，通風櫥柜風干后加入200μL×TE溶解DNA。（8）加入10μg/μL的Rnase 3μL，37℃水浴1h。（9）加入等體積酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）抽提液，搖床輕輕搖30min。（10）用10 000rpm，25℃，離心15min，將上清液體轉入新的2mL離心管。（11）加入等體積的氯仿：異戊醇（24∶1）抽提液再抽提一次。（12）用10 000rpm，25℃，離心15min，將上清液轉入新的2mL離心管，加入1/10體積的3M乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積的冰凍無水乙醇，慢慢搖勻至沉淀物析出，用槍頭挑出沉淀，用75%乙醇洗3次，至無乙醇味道，在通風櫥柜風干1～2h，DNA呈薄片透明狀時加入50μL×TE溶解。輕輕彈，至樣品完全溶解，放入-20℃冰箱保存備用。

1.3 DNA樣品檢測

1.3.1 紫外光譜檢測 用超純水稀釋少量基因組DNA（稀釋100倍），并用超純水作為空白，利用紫外分光光度計檢測OD260/OD280比值及DNA的濃度。DNA樣品按100倍稀釋后測定其在260nm和280nm處的紫外吸收值，OD260/OD280的比值表示DNA樣品的純度，可判斷有無蛋白質、多糖、RNA等雜質（王關林等，2002）。若OD260/OD280值介于1.8～2.0，則表明DNA純度較好，如果OD260/OD280小于1.8，表明有蛋白質污染；若OD260/OD280值大于2.0，表明DNA樣品里面有RNA污染。然后根據OD比值計算出DNA的濃度和提取率。計算公式為：DNA濃度（μg/μL）=D260nm×100×稀釋倍數/1 000；DNA提取率（μg/g）=DNA濃度（μg/uL）×提取的DNA體積（μL）/試驗材料的用量（g）。DNA濃度（μg/mL）=OD260×樣品稀釋倍數×100。將檢測后的DNA，稀釋至30ng/μL，放入-20℃冰箱保存備用。

1.3.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測 取1μL稀釋好的DNA樣品，每個樣品加入5μL10×loading buffer混勻，于0.8%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100V，電泳40min，電泳結束后用凝膠成像分析系統（Tanon4100）觀察DNA譜帶，并拍照。

1.4 ISSR-PCR反應產物的檢測 ISSR-PCR產物的檢測：反應產物在含有0.5μg/mLGoldview染料的1.8%瓊脂糖凝膠電泳中分離，用DNA Marker（2 000bp）作為相對分子量標記，以100V電壓電泳60min，在紫外凝膠成像系統（Tanon4100）下觀察并照相。

擴增程序參照Zietkiewicz等（1994），具體為：95℃預變性5min；94℃變性40s，引物在篩選后的最佳退火溫度退火55s，72℃延伸1min30s，共計36個循環，循環結束后72℃延伸7min。PCR擴增在Biometra公司的T1PCR儀上進行擴增。

2 結果與分析

2.1 DNA提取結果與檢測 經過改良的CTAB法提取的安諾蘭基因組DNA呈白色絮狀，通風櫥柜自然吹干后為白色透明薄片狀，加入3%β-巰基乙醇和2%PVP40，避免了多糖、多酚等次生物質的擾亂，有效防止了褐變。經過紫外分光光度計檢測DNA的OD值，其OD值都在1.799～2.300，說明該法能較完全地去除蛋白質、酚類及多糖等雜質，對殘留的氯仿、無機鹽等也能去除干凈，適合對安諾蘭DNA基因組的提取。

用0.8%的瓊脂糖膠檢測提取的DNA的質量表明：用改良的CTAB法提取的安諾蘭基因組DNA在瓊脂糖凝膠電泳上能呈現清楚的DNA光亮條帶，不彌散，沒有拖尾現象（圖1）。

圖1 安諾蘭DNA0.8%瓊脂糖凝膠電泳圖

注：1～4為安諾蘭花序；5～8為安諾蘭嫩葉；9～12為安諾蘭苞葉；13～16為安諾蘭氣生根；17～20為安諾蘭老葉。

2.2 不同部位DNA的純度和提取率 用紫外分光光度計檢測各個處理的DNA的D260nm、D280nm值，分別計算出D260nm/D280nm、DNA濃度和提取率（表1）。結果表示，安諾蘭嫩葉提取率和純度都很高，D260nm/D280nm處于1.8～2.0，老葉的D260nm/D280nm大于2.0，表明樣品還有RNA污染，須進一步除RNA。從提取率看嫩葉的提取率最高，其次是苞葉和花序，氣生根和老葉純度和提取率均很低。

3 結論與討論

研究結果，安諾蘭不同部位DNA的提取純度都很高，表明安諾蘭的5個不同部位都可以進行DNA的提取，但是DNA提取濃度和提取率各不相同，嫩葉的提取率最高，苞葉和花序次之，老葉和氣生根提取率低。安諾蘭的老葉由于提取率低，有雜質污染，且質地較硬，很難研磨，最好不選用進行DNA的提取。氣生根提取率也不高，且根系損傷對植株生長影響較大，為不使整株受影響，根系提取DNA也不可行。苞葉和花序可作為安諾蘭DNA提取的選擇材料，但以嫩葉的提取率最高，且純度好，提取過程中要注意RNA的污染。

本實驗用改良的CTAB法適合安諾蘭基因組DNA的提取，且DNA的質量好，純度高，完全能滿足安諾蘭ISSR-PCR擴增的要求。

參考文獻

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（責編：張宏民）