牛肉組織中硝基咪唑類藥物殘留檢測方法研究

李小橋 武 煊 李玉平 蘇亮

摘 要：建立了超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）測定牛肉組織中地美硝唑（DMZ）、甲硝唑（MNZ）、洛硝達唑（RNZ）和替硝唑（TNZ）殘留量的檢測方法。樣品經乙酸乙酯提取，正己烷除脂，PLS（親水親脂平衡柱）固相萃取柱凈化后，以C18反相色譜柱為分析柱，0.1%甲酸水-乙腈為流動相，采用電噴霧電離源（ESI+），選擇反應監測模式（SRM）進行檢測。結果表明，4種硝基咪唑類藥物響應值與其質量濃度在1.00～25.00ng/mL范圍內線性良好，相關系數r2在0.998 6以上；在0.2、1.0和2.0μg/kg添加水平下DMZ、 MNZ、 RNZ和TNZ回收率在64.4%～96.6%范圍內，批內、批間變異系數小于15%；4種藥物檢測限（LOD）為0.1μg/kg，定量限（LOQ）為0.2μg/kg。方法滿足于牛肉中上述單種或多種種硝基咪唑類藥物殘留檢測。

關鍵詞：UPLC-MS/MS；硝基咪唑類藥物；牛肉；殘留

中圖分類號 S823 文獻標識碼 B 文章編號 1007-7731（2013）09-28-04

硝基咪唑類藥物（nitroimidazoles）是一類具有5-硝基咪唑環結構的藥物，包括甲硝唑（metronidazole，MNZ）、地美硝唑（dimetridazole，DMZ）、洛硝達唑（ronidazole，RNZ）和替硝唑（tinidazole，TNZ）等。該類藥物主要用于治療和預防厭氧菌引起的局部或系統感染，抑制厭氧菌的DNA合成，也用于抗滴蟲和阿米巴原蟲等。由于硝基咪唑類藥物含有的硝基雜環類化合物具有細胞誘變性，從而導致此類藥物有致癌作用和潛在的致畸作用[1-2]，因此硝基咪唑類藥物在大多數國家為禁止使用或允許使用但必須嚴格監控的藥物[3-4]。我國農業部235公告中[5]，地美硝唑、甲硝唑在動物中允許作治療用，但不得在動物性食品中檢出藥物，洛硝達唑為禁止使用的藥物，在動物性食品中不得檢出，但替硝唑沒有明確的使用和殘留限量規定，因此，在實際生產中替硝唑有可能代替其他硝基咪唑類藥物應用于獸醫臨床，存在潛在的毒副作用。

硝基咪唑類藥物的化學性質較不穩定，見光、遇熱易分解，檢測其在動物性食品中的殘留較為困難。隨著檢測技術的發展，質譜法用于動物性食品中藥物殘留檢測的報道越來越多，且能夠對待檢物進行確證，常用的有液相色譜質譜或串聯質譜聯用法（LC-MS/MS）[6-8]和氣相色譜質譜（GC-MS）或串聯質譜聯用法（GC-MS/MS）[9]，由于氣相色譜質譜法需要對極性、非揮發性、熱不穩定的待檢化合物進行衍生化，而且對衍生化條件要求十分嚴格，因此選用液質聯用技術尤其是LC-MS/MS進行動物組織或產品中硝基咪唑類藥物殘留的檢測具有較大優勢。目前，國內外報道在豬組織、禽類組織、蜂蜜和飼料中硝基咪唑類藥物殘留檢測方法較多，而對牛肉組織中硝基咪唑類藥物LC-MS/MS檢測法報道較少，本試驗旨在建立一種簡便、準確的測定牛肉中硝基咪唑類藥物殘留的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料 超高效液相色譜-串聯質譜儀（UPLC-MS/MS）：TSQ ULTRAL，美國Thermo Scientific公司；色譜柱：Thermo Gold C18色譜柱（150mm×4.6mm，2.1μm），美國Thermo Scientific公司；電子天平：AE250，瑞士Mettler公司；旋轉蒸發儀：Laborota4000型，德國Heidolf公司；高速冷凍離心機：SIGMA 3K30，德國SIGMA公司；渦旋振蕩儀：SIR4，德國IKA公司；空氣搖床：KS260，德國IKA公司；氮吹儀：TTL-DCII型，北京同泰聯科技發展公司。

地美硝唑、甲硝唑、洛硝達唑和替硝唑對照品：均購自德國Dr Ehrenstorfer公司（4℃冷藏保存）；甲醇、乙腈：色譜純，均購自德國SIGMA公司；無水硫酸鈉、正己烷、乙酸乙酯：分析純，均購自重慶邁克公司；PLS（親水親脂平衡柱）固相萃取小柱：60mg/3mL，北京迪馬科技有限公司。

牛肉樣品：采集于重慶某超市生鮮部。

1.2 標準工作液配制 精確稱取地美硝唑、甲硝唑、洛硝達唑和替硝唑對照品各10.0mg，用甲醇定容至50mL，制成濃度為200μg/mL的標準儲備液，再精確量取1.0mL的標準儲備液，定容至100mL，配成2μg/mL的標準工作液，標準工作液臨用時再逐級稀釋。

1.3 UPLC-MS/MS分析條件

1.3.1 液相條件 流動相：A：0.1%甲酸水，B：乙腈，梯度洗脫程序：0～1min，95%A線性變化至70%A；1～6min，保持70%A；6.0～6.1min，70%A線性變化至95%A；6.1～10min，保持95%A。流速：250μL/min；進樣量：10μL。

1.3.2 質譜條件 監測模式：選擇反應監測（SRM）模式；離子源：電噴霧電離源（ESI+）；噴霧電壓4.5kV；蒸發氣溫度：150℃；毛細管溫度：350℃；鞘氣：30L/H，輔氣：5L/H。4種硝基咪唑類藥物選擇反應監測模式下參數見表1。

1.4 樣品處理

1.4.1 提取 稱取（5.00±0.05）g牛肉于50mL塑料離心管，加入無水硫酸鈉4g，再加入15mL乙酸乙酯，渦旋1min，振蕩10min后，6 000r/min轉速下離心5min，上清液轉移至100mL雞心瓶，殘渣再用15mL乙酸乙酯提取一次，合并上清液，于40℃水浴中旋轉蒸發至干；用1mL甲醇、2mL 1%醋酸溶液和3mL正己烷溶解雞心瓶中殘留物，轉移至50mL塑料離心管，重復以上操作一次，合并2次溶液，渦旋振蕩2min，3 000r/min轉速下離心5min，棄掉正己烷層，下層溶液中再加入6mL正己烷重復除脂一次，最后在下層溶液中加入6mL去離子水混勻，備用。

1.4.2 凈化 依次用3mL甲醇和3mL水活化SPE小柱，將上述備用液全部轉移上柱，流速不超過1mL/min，再用3mL水和2%甲醇溶液淋洗SPE小柱，擠干，用5mL甲醇洗脫，收集洗脫液，40℃下氮氣吹干，1mL流動相（5%乙腈-0.1%甲酸溶液）定容，取10μL上超高效液相色譜-串聯質譜儀進行分析。

2 結果與分析

2.1 提取與凈化條件優化 硝基咪唑類藥物見光、遇熱易分解，整個試驗過程要求在避光、較低溫度下快速完成。對于動物組織中硝基咪唑類藥物殘留而言，常用的提取溶劑有乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲苯、鹽酸等[10-11]。由于二氯甲烷和甲苯有較強的毒性，本試驗選擇乙腈和乙酸乙酯進行了比較，二者提取回收率相當，但是相對于乙酸乙酯，乙腈提取動物組織時會提取更多極性基質[10-11]，且乙腈提取液在旋轉蒸發過程中容易沸騰，操作較難控制，而乙酸乙酯沸點較低，提取液在較低溫度下也能快速蒸發至干，因此本試驗選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。

硝基咪唑類藥物在酸性環境下呈離子狀態，易容于水溶液，而在堿性環境下呈分子狀態，易溶于有機溶劑[12]，因此其凈化過程可以選擇液液萃取除脂，本試驗選擇醋酸溶液和甲醇復溶雞心瓶殘留物，再用正己烷除脂；另外，本試驗過程中還篩選了SCX強陽離子交換柱、PLS親水親酯平衡柱和C18等固相萃取柱進行凈化，實驗結果發現使用SCX柱時，地美硝唑、甲硝唑和洛硝達唑回收率只能達到40%～50%，而C18柱對甲硝唑保留效果也不太理想，平均回收率不到60%，但是PLS柱能提高甲硝唑平均回收率到70%左右，其它硝基咪唑類藥物均能達到80%～95%，因此本試驗選取PLS親水親酯平衡柱進行凈化。試驗還對4種藥物在樣品中基質效應進行了研究，分別向空白樣品基質溶液和流動相中添加4種混合標準溶液，制成相同濃度樣品各5份，上機進行檢測，分別比較4種藥物的響應值，結果表明，在兩種基質中差異不明顯，因此可以忽略基質效應對實驗結果的影響。

2.2 檢測條件的優化 試驗選擇甲醇-甲酸水體系和乙腈-甲酸水體系作為流動相進行比較，結果發現，使用甲醇-甲酸水體系時，在Thermo Gold C18色譜柱上，4種硝基咪唑類藥物完全不能分開，后者能完全分離4種目標化合物（見圖1），因此本方法選擇乙腈-甲酸水作為流動相。

DMZ、MNZ、RNZ和TNZ化合物在ESI+模式下響應很高，都以[M+H]+形式分別形成其質子化分子離子。再對其質子分子離子進行二級質譜掃描，結果表明，對于DMZ，分子離子電離失去NO2得到其主要離子碎片m/z=96.2；MNZ分子離子電離失去CH2CHOH得到其主要離子碎片m/z=128.1；RNZ失去HOCONH2得到m/z=140.2主要離子碎片；TNZ分子離子電離丟失5-硝基咪唑環得到m/z=121.1主要離子碎片（見表1）。最后對4種藥物的8個離子對在SRM選擇離子監測模式下進行優化，選擇響應值最高時的碰撞能和透鏡電壓（見表1）。

2.3 標準曲線、檢測限與定量限

2.3.1 標準曲線 將1.2中2μg/mL的標準工作液用流動相逐級稀釋成濃度為1、2、5、10、20和25μg/L，在1.3 UPLC-MS/MS分析條件下測定，以各種藥物特征離子質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標作圖，制得標準曲線。結果表明，4種硝基咪唑藥物在1.00～25.00μg/L范圍內線性關系良好，線性方程、相關系數（見表2）。

2.3.2 檢測限與定量限 采用在空白樣品中添加4種硝基咪唑類藥物的方法，依據特征離子色譜峰信噪比S/N>3為方法檢測限（LOD），S/N>10為方法定量限（LOQ），測得4種硝基咪唑類藥物檢測限為0.1μg/kg，定量限為0.2μg/kg。

2.4 準確度和精密度 在空白牛肉中加入由2μg/mL的標準工作液稀釋成10、50和100μg/L的工作液各100μL（添加水平相當于0.2、1、2μg/kg），按1.4進行前處理，1.3條件進行檢測，對每個加標水平做5個平行試驗，重復3次，計算回收率和批內、批間變異系數，分別考察方法的準確度和精密度。

結果表明，在0.2、1.0和2.0μg/kg添加水平下DMZ平均回收率分別是84.9%、91.2%和90.1%，MNZ平均回收率分別是67.5%、73.8%和75.5%，RNZ平均回收率分別是81.5%、84.0%和85.0%、TNZ平均回收率分別是94.2%、93.1%和94.7%，批內、批間變異系數小于15%，說明本方法準確度和精密度較高，滿足于牛肉中硝基咪唑類藥物殘留檢測要求。回收率結果見表3。

3 結論

本文建立了牛肉中地美硝唑（DMZ）、甲硝唑（MNZ）、洛硝達唑（RNZ）和替硝唑（TNZ）的超高效液相色譜-串聯質譜法殘留檢測方法。樣品經乙酸乙酯提取，正己烷除脂，PLS（親水親脂平衡柱）固相萃取柱凈化，采用電噴霧電離源（ESI+），選擇反應監測模式（SRM）進行檢測。4種硝基咪唑類藥物在0.2、1.0和2.0μg/kg添加水平下的回收率在64.4%～96.6%范圍內，批內、批間變異系數小于15%，檢測限（LOD）為0.1μg/kg，定量限（LOQ）為0.2μg/kg，結果表明該方法穩定可行、靈敏度高，且分析過程簡單快速，適用于牛肉中硝基咪唑類藥物殘留檢測。

參考文獻

[1]汪紀倉，王大菊，林霖，等. 硝基咪唑類藥物殘留檢測方法研究進展[J]. 中國獸藥雜志，2007，41（8）：31-33.

[2]沈建忠，項新華，張躍，等. 家禽肌肉組織中硝基咪唑類藥物高效液相色譜檢測法研究[J]. 中國農業科學，2003，36（6）：700-703.

[3]DOMNIQUE H P，BERNARD D，MICHEL L. Determination of four nitrioinidzole residuces in pourltry meat by liquid chromatography-mass spectrometry[J]. J Chromatogr A，2000，882：89-98.