Toll樣受體4對巨噬細胞脂周素2表達的影響

范 斌， 韓 冬， 谷劍秋， 馮 娟

動脈粥樣硬化是腦血管病的病理基礎，而泡沫細胞的形成是動脈硬化的早期事件［1］。多種因素參與泡沫細胞形成。其中細胞內脂肪滴表面蛋白成為近年研究的熱點。PAT家族蛋白是細胞內脂肪滴表面主要結構蛋白。目前發現的成員包括脂周素1(perilipin1)、脂周素2(perilipin2;又名adipose differentiation-related protein，ADRP)、脂周素 3(perilipin3;又名 TIP47)。

其中脂周素2在泡沫細胞和動脈硬化斑塊中選擇性高表達［2，3］。研究表明“敲除”或“沉默”脂周素2基因，可減少巨噬細胞對游離脂肪酸及膽固醇的攝取，進而抑制泡沫細胞的形成，阻止動脈粥樣硬化的發生和發展。故脂周素2是抑制泡沫細胞形成作用藥物的關鍵靶點［4］。但目前對脂周素2表達的調控機制研究卻較少。

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)可以被病原體相關分子模式(pathogen-associated molecule patterns，PAMP)識別。目前發現人TLR家族包括12名成員，其中TLR4信號傳導通路參與泡沫細胞形成［5，6］。但關于 TLR4調節泡沫細胞形成機制仍未明確。鑒于脂周素2在泡沫細胞形成中的重要作用，因此本研究檢驗TLR4信號傳導通路對脂周素2表達的影響，并揭示其作用的分子機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑LPS(Sigma，美國)，放線菌素D(Sigma，St.Louis，MO)，c-Jun NH2-terminal kinase(JNK)inhibitor II(JNKI)(Calbiochem La Jolla，CA)，脂周素2單克隆抗體(Progen Biotechnik，德國)，GAPDH單克隆抗體，過氧化物酶偶聯羊抗豚鼠IgG及羊抗鼠抗體(Santa Cruz Biotechnology，美國)，Western blotting檢測試劑盒(GE Healthcare)，轉染試劑，Lipofectamine Plus Reagent(Invitrogen)，熒光素發光檢測試劑盒(Promega)，逆轉錄ReverTra Ace-a kit試劑盒(Toyobo，Osaka 日本)，Real time PCR SYBR Green試劑盒(Bio-Rad)，空白 pGL3熒光素酶報告質粒，包含脂周素2啟動子-2090bp區域的pGL3質粒，對照pRL-TK質粒由日本九州大學生山祥一郎教授慷慨提供。

1.2 細胞培養 RAW264.7鼠巨噬細胞株(RIKEN，日本)，1 ×106接種于10mlα-MEM 培養基中(100ml/L胎牛血清，1×105U/L青霉素)，置于37℃、CO2恒溫培養箱中，1～2d傳代一次。

1.3 Real-time PCR 使用Isogen，按說明書提取總 RNA，取0.5μg/ml總 RNA，用逆轉錄 ReverTra Ace-a kit試劑盒，按使用說明書操作合成單鏈cDNA，鼠脂周素 2上游引物序列 5’-CTGTCTACCAAGCTCTGCTC-3’，下游引物序列 5’-CGATGCTTCCTTCCACTCC-3’。GAPDH，上游引物序列為5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物序列為5’-TCCACCACCCTGTTGCTTA-3’，用 SABR Green Real-time PCR熒光試劑盒，按說明書操作，以GAPDH為內參照物，脂周素2量以對GAPDH相對誘導倍數表示。

1.4 Western blotting 用4℃預冷裂解液(含pH 7.5 的 50mmol/L Tris-HCl、0.5g/L Nonidet 40、1mmol/L EDTA、1mmol/L EGTA、150mmol/L NaCl、100ml/L甘油、50mmol/L氟化鈉、10mmol/L焦磷酸鈉、1mmol/L 礬酸鈉、80μmol/L β-甘油磷酸、1mmol/L PMSF、10mg/L aprotinin、100mg/L soybean trypsin inhibitor和10mg/L leupeptin)裂解細胞。取25μg蛋白，95℃變性5min后經12%SDS-PAGE行垂直電泳，100V ×90min，室溫100V ×100min轉膜，50g/L牛奶室溫封閉1h。結合一抗(豚鼠抗鼠脂周素2mAb，1∶200稀釋) ，室溫 1h，結合二抗(羊抗豚鼠，或羊抗鼠多克隆抗體，1∶20000稀釋)，室溫1h。感光、洗片，蛋白條帶掃描后行光密度分析。

1.5 臨時轉染及熒光素酶活性分析 用Lipofectamine，和PLUS reagent轉染試劑，按使用說明書進行操作，細胞2×105/孔，接種于12孔板，培養24h后，改為無血清培養液培養，轉染混合液50μl(Lipofectamine 2μl，PLUS reagent5μl，1μg 熒光素酶報告質粒，0.4μg pRL-TK質粒，用無血清培養液調整至50μl)，37℃轉染4h。1×PBS洗滌，改為含胎牛血清α-MEM培養液及相應濃度ODN1826培養24h，收集并裂解細胞，使用Dual-Luciferase Reporter Assay System熒光素酶檢測系統，按說明書操作進行熒光素酶活性檢測。根據對照質粒pRL-TK Renilla活性標準化轉染效率。

2 結果

2.1 LPS對巨噬細胞脂周素2表達的影響我們使用LPS，TLR4的配體，檢測了TLR4信號傳導通路對巨噬細胞脂周素2表達的影響。結果顯示，LPS以劑量依賴的方式顯著增加了脂周素2mRNA和蛋白的表達水平，由于100ng/m l LPS誘導脂周素2表達最顯著且未見毒性作用，因此選用該濃度進行研究。在該濃度下，LPS以時間依賴的方式誘導了脂周素2mRNA和蛋白的表達，刺激24h后表達最明顯。

2.2 LPS在轉錄水平調節脂周素2表達 為進一步研究LPS誘導脂周素2表達分子機制，我們檢測了放線菌素D對脂周素2表達的影響。如我們所料，放線菌素D幾乎完全抑制了LPS誘導的脂周素2表達，提示LPS是在轉錄水平調節脂周素2表達。為進一步驗證以上結論，我們構造了包含脂周素2啟動子區域-2090bp的熒光素酶報告質粒，檢測LPS對脂周素2啟動子活性的影響，熒光素酶表達分析顯示，LPS以劑量依賴方式顯著刺激了啟動子活性。

2.3 LPS誘導脂周素2表達需要AP-1的活性研究證明TLR4調節的信號通路包括激活AP-1，我們以前在脂周素2啟動子區域鑒定存在Ets/AP-1位點，因此我們檢測了AP-1抑制劑對脂周素2表達的影響，JNK抑制劑(SP-600125)以濃度依賴方式抑制了LPS誘導的脂周素2表達。

3 討論

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是引起多種心腦血管疾病的病理基礎。巨噬細胞、平滑肌細胞都能轉化為泡沫細胞，但巨噬細胞是早期動脈粥樣硬化損傷中泡沫細胞的主要來源。研究表明泡沫細胞形成與脂周素2密切相關。脂周素2屬脂肪滴周圍蛋白PAT家族成員，PAT家族蛋白以脂滴表面為平臺對三酰甘油代謝進行調節。越來越多的研究表明，脂滴并不是簡單的中性脂質貯存庫，而是活躍的細胞器，與細胞多方面的生物功能有關。脂周素2具有多個脂滴結合結構域，分布于幾乎所有細胞系中，在發生脂肪變性的肝細胞、巨噬細胞、泡沫細胞、動脈硬化斑塊中選擇性地高表達［2］。通過對建立脂周素2基因“高表達”巨噬細胞株的研究表明，脂周素2“高表達”促進巨噬細胞對游離脂肪酸及ox-LDL吸收，導致泡沫細胞形成［1］。此外，脂周素2基因“敲除”可抑制泡沫細胞形成并進而阻止動脈粥樣硬化的發生發展［4］。

以上研究結果表明，脂周素2在泡沫細胞形成中扮演重要作用，但對脂周素2表達調控機制的研究卻較少。

Toll樣受體首先在果蠅中發現，哺乳動物包括人類也存在一組結構功能都與Toll樣受體同源的結構域，被稱為Toll樣受體家族。TLR4在巨噬細胞中高表達，參與動脈粥樣硬化的形成。內源性或外源性配體刺激TLR4，促使巨噬細胞分泌炎癥因子或化學因子，在 ox-LDL的刺激下轉化為泡沫細胞［6，7］。鑒于脂周素2在泡沫細胞形成中的重要作用，因此我們研究TLR4信號通路是否可影響脂周素2的表達。

本研究證明，TLR4的配體LPS以濃度及時間依賴方式顯著刺激了巨噬細胞脂周素2mRNA及蛋白的表達。100ng/ml LPS誘導最明顯的表達，此結果提示脂周素2參與TLR4誘導泡沫細胞形成的過程。

接下來，我們研究了TLR4信號通路誘導脂周素2基因表達的分子機制。首先我們檢測了轉錄抑制劑放線菌素D對脂周素2表達的影響，2.5μg/ml放線菌素D顯著抑制了脂周素2的表達，此結果提示TLR4信號通路是通過刺激轉錄進而直接刺激脂周素2表達的。為驗證以上結論，我們檢測了LPS對啟動子活性的影響，LPS以濃度依賴的方式顯著刺激了脂周素2啟動子的活性，與對照相比100ng/ml LPS誘導了約8倍的熒光素酶活性，以上結果提示TLR4信號通路至少通過直接方式即直接刺激轉錄活性進而刺激脂周素2表達。

放線菌素D并沒有完全抑制脂周素2表達，提示TLR4信號有可能通過間接方式刺激脂周素2表達。研究表明TLR4信號可刺激多種炎性細胞因子表達，如:IL-6、IL-1α、IFN-β、TNF-α 等，而以上炎性細胞因子正是誘導脂周素2的誘導劑［8，9］。故我們推測TLR4信號有可能通過間接方式即通過刺激炎性細胞因子表達進而刺激脂周素2表達。此推論需要進一步加以證明。

TLR4信號通路可激活多種轉錄因子，包括AP-1，而我們以前證明脂周素2啟動子區域Ets/AP-1位點參與PMA誘導的脂周素2表達，并且AP-1及PU-1選擇性結合此位點［10］。故我們檢驗AP-1抑制劑對脂周素2表達的影響。JNK抑制劑(SP-600125)顯著抑制了脂周素2表達。提示LPS誘導脂周素2表達需要AP-1的活性。

總之，我們的研究證明了TLR4信號通路誘導巨噬細胞脂周素2基因表達，并進一步揭示其分子機制。提示脂周素2參與TLR4誘導泡沫細胞形成過程，脂周素2是防治炎癥誘導的動脈粥樣硬化藥物開發的作用靶點。

［1］郭 陽，鄭東明，劉曉梅，等.低密度脂蛋白受體基因 NcoⅠ、ApoC-Ⅲ基因SacⅠ多態性與動脈粥樣硬化腦梗死關系［J］.中國現代醫學雜志，2006，16(5):641-644.

［2］Brasaemle DL，Barber T，Wolines NE，etal.Adipose differentiationrelated protein is an ubiquitously expressed lipid storage droplet-associated protein［J］.JLipid Res，1997，38(5):2249-2263.

［3］Kimmel AR，Brasaemle DL，Mcanfrews-Hill M，etal.Adoption of PERILIPIN as a unifying nomenclature for themammalian PAT-family of intracellular，lipid storage droplet proteins［J］.J Lipid Res，2010，51(3):468-471.

［4］Paul A，Chang BH，Li L，etal.Deficiency of adipose differentiationrelated protein impairs foam cell formation and protects against atherosclerosis［J］.Circ Res，2008，102(12):1492-1501.

［5］Rock FL，Hardiman G，Timans JC，etal.A family of human receptors structurally related to Drosophila Toll［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(2):588-593.

［6］Michelsen KS，Wong MH，Shan PK，etal.Lack of Toll-like receptor4 ormyeloid differentiation factor 88 reduces atherosclerosis and alters plaque phenotype inmice deficient in apolipoprotein E［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(29):10679-10684.

［7］Mullick AE，Tobias PS，Curtiss LK.Modulation of atherosclerosis in mice by Toll-like receptor 2［J］.JClin Invest，2005，115(11):3149-3156.

［8］Gu JQ，Lkuyama S，Wei P，etal.Pycnogenol，an extract from French maritime pine，suppresses Toll-like receptor 4-mediated expression of adipose differentiation-related protein in macrophages［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2008，295(6):E1390-E1400.

［9］Fan B，Ikuyama S，Gu JQ，etal.Oleic acid-induced ADRP expression requires both AP-1 and PPAR response elements，and is reduced by Pycnogenol through mRNA degradation in NMuLi liver cells［J］.Am JPhysiol Endocrinol Metab，2009，297(1):112-123.

［10］Wei P，Taniguchi S，Sakai Y，etal.Expression of adipose differentiation-related protein is conjointly regulated by PU.1 and AP-1 in macrophages［J］.JBiochem，2005，138(4):399-412.