遼細辛根莖試管生根苗培養的研究

孫婧靚　杜沙沙　鄭佳楠　鄒俠　姜長陽

摘 要：以根莖為材料，采用組織培養的方法，對遼細辛進行了芽生長培養、生長苗分化培養、不定芽分化培養和生根培養，以及生根苗的移栽和定植的研究。結果表明：以爐灰渣為培養基支持物，1/2MS+ NAA0.1 mg·L-1+6-BA 0.8 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1是根莖生長苗培養的適宜培養基；2/3MS+蔗糖30 g·L-1+NAA0.3 mg·L-1+ ZT1.5 mg·L-1是生長苗分化培養的適宜培養基；1/2MS+蔗糖15 g·L-1+ABT2號1.0 mg·L-1+IBA0.6 mg·L-1是生根苗培養的適宜培養基；在溫室中移栽于營養缽中的生根苗成活率為97.8%，移栽于苗床上的成活率為98.3%；定植成活率為99.5%。定植的生根苗保持了野生遼細辛的所有植物學性狀。

關鍵詞：遼細辛；根莖；組織培養；生根苗

中圖分類號：Q813.1+2；S567.2 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.08.006

遼細辛（Asarum heterotropoides Fr.Schmrdt var.mandshuricum（Masim.）Kitagawa）又稱北細辛、山細辛，屬于馬兜鈴科細辛屬多年生草本植物[1]，生長在腐殖質土層較厚的陰濕林下及陰山坡上，在大連地區的莊河市、瓦房店市有分布[2]。遼細辛的根莖做中草藥用，具有散寒祛風、止痛、溫肺化飲、通竅等功效，能治肺寒咳喘、風濕關節疼、頭疼、牙疼、鼻塞、鼻淵和口瘡等疾病[3-4]。將遼細辛曬干后磨成全草粉作為家禽的飼料添加劑，也能明顯降低家禽的發病率。由于遼細辛對人和家禽具有多種藥用價值，一直以來，人們都在大量地采挖藥用，使本來分布與數量就很少的遼細辛現在在大連的莊河和瓦房店已經很難采到，幾近成為瀕危的野生藥用植物。為保護遼細辛的野生資源，筆者以其根莖為材料，進行了試管苗培養的研究。

1 材料和方法

1.1 材 料

秋季，將在瓦房店市萬家嶺山坡上發現的多株遼細辛的生長位置做好標記。2009年4月中旬，待遼細辛的根莖即將萌發時將其挖回實驗室，將根莖的上細長根剪掉，再把具有待萌發芽的上部剪下2.0～2.5 cm作為試驗材料備用。

把剪下的具有待萌發芽的根莖上部，放到200 mL的磨口廣口瓶中，參見王宇等[5]滅菌方法進行滅菌。

培養條件參見翻白草的研究[6]。

1.2 方 法

1.2.1 根莖芽的生長培養 在超凈工作臺上，把滅菌后的根莖下部切掉，把具有待萌發芽的上部保留0.8 cm左右，分別接種到不加支持物的液體培養基，以胨力強度240 g·cm-2的瓊脂為支持物，以干凈河沙為支持物和以顆粒狀爐灰渣為支持物的1/2MS+ NAA0.1 mg·L-1+6-BA0.8 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1的4種培養基上，進行不同培養基支持物對根莖芽生長的影響試驗。重復2次，每種處理接種培養20個材料。

1.2.2 生長苗分化培養 把生長苗從基部切下后，接種到以2/3MS+蔗糖30 g·L-1為基本培養基，附加NAA0.3 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1、NAA0.3 mg·L-1+ KT 1.5 mg·L-1、NAA0.3 mg·L-1+ KT 2.0 mg·L-1、NAA0.3 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1、NAA0.3 mg·L-1+6-BA1.5 mg·L-1、NAA0.3 mg·L-1+6-BA2.0 mg·L-1、NAA0.3 mg·L-1+ZT1.0 mg·L-1、NAA0.3 mg·L-1+ ZT1.5 mg·L-1、NAA0.3 mg·L-1+ ZT2.0 mg·L-1 9種培養基上，進行不同濃度的生長調節劑組合對生長苗分化的影響試驗。重復2次，每種處理接種培養100個生長苗。

1.2.3 生根培養 把分化培養的2 000個高度在1.5 cm左右的不定芽從基部剪下，接種到以1/2MS+蔗糖15 g·L-1+ABT2號（2號生根粉）1.0 mg·L-1為基本培養基，附加濃度分別為0.3，0.6，0.9，1.2，1.5 mg·L-1的2，4-D、IBA、NAA和IAA 4種不同濃度生長素的培養基上，進行不同種類、不同濃度的生長素對生根苗培養的影響試驗。每種處理接種培養100個不定芽。

1.2.4 生根苗移栽與定植 3月20日，把培養的510株生根苗移栽到上層為干凈河沙的溫室營養缽中，其余540株移栽到上層為干凈河沙的溫室苗床上。

5月20日把移栽成活的1 024株生根苗一次性定植于大連旅順的上坡上。定植后除了移栽前松土和澆1次透水外，其它按照野生條件管理。

2 結果與分析

2.1 不同培養基支持物對根莖芽生長的影響

2次重復試驗獲得了基本一致的結果。培養到40 d時統計證明：對于這4種處理，在不加支持物的液體培養基中，培養材料不生長。而在加入了3種支持物的培養基中，培養根莖上都能生長為生長苗，但生長的程度不同。其中在以爐灰渣為支持物的培養基上的培養材料生長程度最好，不僅2次試驗生長苗的平均生長率均達到了95%，而且外觀上生長苗生長旺盛。觀察表明，在以爐灰渣為支持物的培養基上，培養到第7天時，可見有的材料上部生長出小芽。之后，生長率不斷提高，小芽也逐漸生長為具有2～4個葉片的小苗。在上述試驗的基礎上，2010年，研究者一次性在以爐灰渣為支持物的1/2MS+ NAA0.1 mg·L-1+

6-BA0.8 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1這種培養基上接種培養了1 100個待萌發的根莖段，40 d后獲得了1 051個生長苗。以上結果證明，以爐灰渣為培養基支持物， 1/2MS+ NAA0.1 mg·L-1+6-BA 0.8 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1這種培養基是遼細辛根莖生長苗培養的適宜培養基。

2.2 不同濃度生長調節劑組合對生長苗分化的影響

接種后培養至50 d時進行統計，結果見表1。在所試驗的9種不同濃度生長調節劑組合中， 在KT 與NAA的組合中培養的生長苗不能分化出不定芽，在NAA與6-BA的組合中生長苗分化的效果也不理想，而在不同濃度的NAA與ZT的組合中生長苗分化的效果較好。其中在NAA0.3 mg·L-1+ ZT1.5 mg·L-1組合中的分化效果最好，不僅分化率達到了99%，而且每個生長苗平均分化的不定芽數最多，分化的不定芽長勢最好。2次重復試驗的結果基本一致。在上述分化試驗的基礎上，研究者一次性在2/3MS+蔗糖30 g·L-1+ NAA0.3 mg·L-1+ ZT1.5 mg·L-1這一培養基上接種培養了600個生長苗，經過50 d的培養試驗，培養分化出3 152個生長旺盛、高約1.2 cm的不定芽，其他結果也與2次重復試驗基本一致。以上試驗結果證明：NAA0.3 mg·L-1+ ZT1.5 mg·L-1這一生長調節劑組合是遼細辛生長苗分化培養的適宜生長調節劑組合，也就是說2/3MS+蔗糖30 g·L-1+NAA0.3 mg·L-1+ ZT1.5 mg·L-1這一培養基是遼細辛生長苗分化培養的適宜培養基。

2.3 不同種類、不同濃度生長素對不定芽生根培養的影響

接種后32 d觀察統計，結果見表2，在附加2，4-D與NAA 2種不同濃度生長素的培養基上培養的不定芽不能生長為生根苗；而在附加IBA和IAA 2種不同濃度生長素的培養基上，不定芽均能不同程度地生長為生根苗，其中，在附加不同濃度IBA的培養基上培養的不定芽生長為生根苗的效果好于IAA。而在附加不同濃度IBA的培養基上，在濃度為0.6 mg·L-1的培養基生根培養的效果最好。不僅培養的試管苗平均高度最高、根數最多、生根率最高（達到了98%），而且所培養的生根苗長勢明顯較其它處理旺盛。在上述試驗的基礎上，又一次性培養了1 106個不定芽，并接種到1/2MS+蔗糖15 g·L-1+ABT2號（2號生根粉）1.0 mg·L-1+IBA0.6 mg·L-1培養基上進行生根培養，共培養出生長旺盛的試管苗1 087株，生根苗形成率達到了98.3%。以上生根培養的結果證明：IBA為0.6 mg·L-1的生長素濃度是遼細辛不定芽生根苗培養的理想生長素濃度，也就是說，1/2MS+蔗糖15 g·L-1+ABT2號（2號生根粉）1.0 mg·L-1+IBA0.6 mg·L-1培養基是遼細辛生根苗培養的適宜培養基。

2.4 生根苗移栽與定植

移栽于營養缽中的510株生根苗，成活了499株，成活率為97.8%；移栽于苗床上的540株生根苗，成活了531株，成活率為98.3%。

定植后58 d統計，成活了1 016株，成活率為99.5%。

定植成活的生根苗，7月上旬開始迅速旺盛地生長，翌年6月中旬開花，保持了野生遼細辛的植物學性狀。

3 討 論

在研究者對遼細辛進行研究前，前人已經對細辛[7-9]和大花細辛[10]組織培養及試管苗培養進行了研究，盡管本研究對象遼細辛也與細辛和大花細辛都屬于同一屬（細辛屬）植物，但遼細辛不同培養階段所需要的適宜培養基卻出現了較大的差異。產生這種現象盡管與不同實驗室的培養環境不同有關，但更重要的還是由于基因型的差異而引起的。這說明，即使基因型相近的同一屬植物在進行組織培養中，培養環境和適宜的培養基也會產生一定差異。

在本研究中，采用生長苗分化培養的方法進行快速繁殖，其繁殖速度是600個生長苗經過50 d的分化培養，分化出3 152個生長旺盛的不定芽。50 d的繁殖系數為5.25。按照這種繁殖速度，1個生長苗1年能繁殖出約8萬個后代。這種繁殖速度完全能實現人們對遼細辛野生資源的保護和滿足人們栽培的需求。

參考文獻：

[1] 中國科學院北京植物所.中國高更植物圖鑒（第一冊）[M].北京：科學出版社，1972：543.

[2] 韓全忠，王振興.大連地區植物志（上冊）[M].大連：大連理工大學出版社，1993：142-143.

[3] 李書心.遼寧植物志（上冊）[M].沈陽：遼寧科學技術出版社，1988：573-574.

[4] 南京中醫藥大學.中草藥大辭典（上冊）[M].上海：上海科學技術出版社，2006：2085-2088.

[5] 王宇，方晨，劉洋，等.虎杖的組織培養及高效無性系的建立研究[J].江西農業學報，2009， 21（3）：73-76.

[6] 高慧，李恬，李爽，等.翻白草組織培養及無性系建立的研究[J].國土與自然資源研究，2010（4）：84-85.

[7] 張衛東，孔德云.燈盞細辛化學成分研究[J].中國藥學雜志，2008（8）：514-516.

[8] 楊志玲，顏冬蘭，李福雙，等.城南細辛化學成分研究[J].中南藥學，2005（5）：304-305.

[9] 詹立平，張建軍，劉志梅.細辛組織培養技術研究[J].中國當代醫藥，2013，20（4）：65-66.

[10] 南桂仙，金光德.細辛組織培養研究[J].河北農業科學，2009，13（7）：39，117.

[11] 蕭洪東，聶磊，藍旭東，等.細辛組織培養快速繁殖初探[J].佛山科學技術學院學報：自然科學版，2004，22（2）：67-68.

[12] 李洪林，付志惠，康強勝，等.大花細辛的組織培養[J].植物生理學通訊，2005，41（6）：784.