農桿菌介導的ZmHSD1基因轉化玉米自交系

崔慧妮等

摘要：以NPT Ⅱ基因為篩選標記，利用農桿菌轉化系統將目的基因ZmHSD1轉入玉米自交系昌7-2、齊319和18-599的胚性愈傷組織，篩選抗性愈傷，并獲得再生植株。對再生植株基因組DNA進行PCR檢測表明，ZmHSD1基因已經整合到玉米基因組中，并最終獲得轉基因T1代種子。

關鍵詞：玉米；農桿菌；胚性愈傷組織；ZmHSD1基因

中圖分類號：Q785文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）07-0006-03

糖皮質激素是一類動物激素，參與糖、脂肪和蛋白質的生物合成和代謝等過程，還具有抗炎的作用^[1]。11β-羥基類固醇脫氫酶（11β-hydroxysteroid dehydrogenase， 11β-HSD）是調節糖皮質激素的關鍵酶，它促進活性糖皮質激素與非活性激素之間的相互轉換^[2，3]。雖然目前在植物中還沒有鑒定出11β-HSD，但是隨著擬南芥基因組測序工作的完成，發現了八個類似HSD的基因。最先鑒定出的是一種油菜籽HSD，它在利用ABA類似物抑制種子萌發的過程中過量表達^[4]；Jolivet等^[5]證實在芝麻和油料作物中只存在微量的HSD，這些HSD編碼的蛋白表現出與NADP+所依賴的11β-HSD、17β-HSD/17β-類固醇脫氫酶相同的性能^[6]。AtHSD1基因包括6個外顯子和5個內含子，它編碼的蛋白由389個氨基酸組成，李鳳玲等^[7]將AtHSD1的cDNA連接到35S啟動子后整合到擬南芥中，發現轉基因植株明顯比野生株粗壯，其分支和長角果的數量也明顯增多，轉AtHSD1基因植株的表型與過量產生BR或過量表達BR受體基因BRI1的表型一致^[8～10]；同時發現轉基因植株的抗鹽性比野生植株高^[7]。因此，該基因在改善農作物植株生長、提高產量方面有很大的潛力。

本研究利用農桿菌介導的遺傳轉化方法，嘗試將ZmHSD1基因轉入玉米自交系品種，以期獲得轉基因玉米植株，拓寬玉米種質的遺傳背景，為高產穩產玉米品種的選育服務。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1植物材料玉米（Zea mays L.）自交系18-599、齊319和昌7-2。

1.1.2目的基因、載體、菌株ZmHSD1表達載體由山東農業大學生命科學學院基因工程實驗室構建。表達載體中，目的基因為ZmHSD1，其啟動子為Ubi；篩選標記基因為NPTⅡ，其啟動子為CaMV35S（圖1）。本研究所用質粒為PZP211，大腸桿菌菌株為DH5α，農桿菌菌株為LBA4404。

1.2試驗方法

1.2.1培養基在N6改良培養基^[11]的基礎上，添加0.25 mg/L Na2MnO3、0.025 mg/L CuSO4·5H2O和0.025 mg/L CoCl2·6H2O。

1.2.2幼胚愈傷組織受體系統參照孫慶泉等^[11]的方法，取幼胚接種于誘導培養基上，24～25℃暗培養，繼代，選擇誘Ⅱ型愈傷組織為轉化受體。

1.2.3農桿菌介導的遺傳轉化

①農桿菌的培養與活化：將低溫保存的農桿菌菌種LBA4404接種到添加25 mg/L Spe的YEB固體培養基平板上，挑取單菌落接種于含25 mg/L Spe的 YEB液體培養基中，置于搖床上預活化（28℃，200 r/min），取預活化的菌液培養至對數生長期備用。

②愈傷組織浸染：浸染前將新培養的菌液離心沉淀菌體，用液體N6培養基重懸，并稀釋到所需OD值。將Ⅱ型愈傷組織分離成米粒大小的小塊，投放到稀釋好的菌液中浸染。用滅菌的濾紙吸干愈傷表面的菌液，并將其擺放到共培養培養基上暗培養3 d，用頭孢水洗菌。將洗好的愈傷放到恢復培養基上恢復培養。

③抗性愈傷的篩選、分化和再生：恢復培養后的愈傷組織依次轉移到1次、2次、3次篩選培養基上，進行抗性篩選，篩選劑為巴龍霉素。將篩選后存活的愈傷轉到分化培養基上分化成苗。分化苗苗高4～5 cm時轉到生根壯苗培養基上。當苗適度生根后轉到基質（基質∶蛭石=1∶1）中。成活植株轉到大田隔離區。

1.2.4轉基因植株的PCR檢測CTAB法提取基因組DNA。對轉化植株、陽性對照（質粒）和陰性對照（未轉化植株）進行PCR檢測，檢測對象為目的基因ZmHSD1和標記基因NPTⅡ。根據已知的ZmHSD1基因序列，利用primer premier 5.0軟件設計ZmHSD1的引物，上游引物在啟動子內部，下游引物在編碼區內，S： CACGATTCTTCCTCGGCTCCTCT， A： TGCTACTCCTTCCTTTCCTGGCT；標記基因NPTⅡ的引物為S： GTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTG，A： AGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGC。引物由上海生工生物工程公司合成。用25 μl PCR反應體系。擴增反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，59℃退火50 s，72℃延伸50 s，35 個循環；72℃終延伸10 min；4℃保存。1%瓊脂糖凝膠、1%TBE電泳緩沖液電泳，溴化乙錠染色，紫外分析，拍照。

2結果與分析

2.1轉基因植株的獲得

將玉米幼胚（授粉后10～15 d）接種于誘導培養基上，誘導出胚性愈傷組織（圖2-1，2-2，2-3）；將經農桿菌浸染后的愈傷（圖2-4），恢復培養1周，愈傷組織生長狀態有所改善，轉入篩選培養基篩選，1輪后有些愈傷開始變褐，3輪后大部分未轉化愈傷褐化死亡，愈傷組織上出現的小塊鮮活愈傷組織突起基本上為抗性愈傷，抗性愈傷在篩選培養基上生長正常 （圖2-5）；將經過3輪篩選的愈傷轉到分化培養基上光照培養，25 d后愈傷表面開始出現綠色芽點，之后綠色芽點逐漸分化成巴龍抗性苗（圖2-6）；將幼苗轉到生根壯苗培養基上（圖2-7），使苗生根，期間有少量白化苗出現；待苗長出2～3條根、高約10～15 cm時，打開封口膜，煉苗5 d后移栽花盆 （圖2-8）；3周后移栽轉基因隔離區，開花期進行人工自交結實（圖2-9）；最終獲得轉基因種子（圖2-10）。

2.2轉基因植株分子檢測

2.2.1目的基因ZmHSD1的PCR檢測利用ZmHSD1引物對抗性苗基因組DNA進行PCR檢測，有33株抗性苗出現與陽性對照一致的444 bp的特異性擴增條帶（圖3），表明該33株轉基因植株已將外源基因整合到基因組中。

2.2.2標記基因NPT Ⅱ的PCR檢測對已知陽性轉基因植株的基因組DNA進行標記基因NPT Ⅱ的PCR擴增，均得到與陽性對照一致的650 bp的特異性擴增條帶（圖4），表明目的基因PCR檢測的陽性株也全為標記基因陽性株。對標記基因的檢測可以排除玉米基因組中ZmHSD1基因的干擾。

3結論

3個供試玉米自交系18-599、齊319和昌7-2的幼胚都能誘導產生Ⅱ型愈傷組織，其中18-599所獲愈傷組織質量好、數量多，適于大量轉化；齊319和昌7-2愈傷顆粒松散、質量不高，尤其是昌7-2，胚性愈傷數量較少。

經農桿菌轉化共得到899株轉化株，通過PCR檢測初步證明有33株為陽性轉化植株，其中18-599有686株轉化株，陽性株21株，轉化效率為3.06%；齊319有183株轉化株，陽性株10株，轉化率為5.46%；昌7-2有30株轉化株，陽性株2株，轉化率為6.67%。

最終獲得ZmHSD1轉基因玉米T1代種子，為玉米優良品種的選育奠定了基礎。

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