陸地棉‘洞A’育性研究時期的選擇與花蕾外部形態指標間的關系

劉冬梅　周步進　靳明凱　周瑞陽

摘 要：為了分子生物學研究取材方便，確定了陸地棉‘洞A花粉發育時期與花蕾外部形態對應關系：花蕾直徑d=1～2 mm為減數分裂期；d=2～3 mm是4分體形成初期；d=3～4 mm為4分體期；d=4～5 mm處于雙核期；d=5 mm為花粉粒形成初期；d=6 mm是成熟花粉期。

關鍵詞：陸地棉洞A；花粉；發育期；花蕾

中圖分類號：S562 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.06.001

陸地棉‘洞A是一系兩用、增產10%～20%、且纖維品質優于常規棉花的品種，利用‘洞A系已培育出4個陸地棉種內品種：川雜1號，川雜2號，川雜3號和川雜4號，并在此基礎上衍生了一系列抗病、蟲不育系?！碅不育株與可育株除了在育性上存在差異外，在遺傳背景上高度同源，是研究棉花花藥與花粉發育相關基因的理想材料。如何選擇最佳時間點，成為一個獲得關鍵基因成功的關鍵。陸地棉‘洞A是1972年在‘洞庭一號中發現的一個天然不育突變株，經過連續回交選育而獲得的[1]。遺傳分析表明受一對隱性核基因控制，命名為msc1[2]。1992年，鑒定為新基因，定名為ms14[3]。20世紀80年代至今，對于‘洞A的研究主要集中在細胞學觀察及生化研究，對于分子生物學研究基礎薄弱。目前僅限于胡磊[4]使用BSA法獲得2個與ms14基因連鎖的標記，分別是BNL3971和NAU663，其中標記BNL3971距離ms14基因最近，相距16.7 cM。根據已公布的棉花圖譜將ms14基因定位在了Chr.2上。另外，應用cDNA-AFLP技術，分析‘洞A雄性不育、可育材料花粉發育相關基因表達的差異，得到64條差異片段[5]。在植物發育的主要階段至少有60 000個不同的結構基因表達，其中大多數為所有看家基因。Kamalay等[6]和Goldberg等[7]比較了花和營養器官的mRNA后發現，大約有10 000種mRNA為花藥特異性的。盡管在花粉發育過程中，涉及近萬種特異基因的表達，但是自從1987年第一次分離出植物的花藥、花粉特異性基因以來，迄今所發現的花粉發育特異基因也不過幾十種。這些花粉特異基因在植物發育過程中的表達，是受時間和空間調節的。除去某些持續表達的基因外，Mascarenhas[8]將花粉形成過程中的基因表達分成早晚兩個時期，早期基因的表達主要集中在減數分裂后即小孢子單核早期，而在成熟花粉中減少或完全消失；晚期基因的轉錄最早發生于小孢子有絲分裂時期，并且隨著花粉的成熟繼續積累。一般認為早期基因可能編碼細胞骨架蛋白和參與細胞壁形成、淀粉積累的蛋白質。晚期基因表達的蛋白質則在花粉成熟和花粉萌發時起作用?！碅不育株從小孢子母細胞到小孢子成熟的各個時期都產生不同程度的敗育，最主要敗育時期為小孢子單核時期[9]。侯磊等[5]研究發現：在花藥發育的相同時期，不育和可育花粉的譜帶在單核期的差異大于減數分裂期?；ǚ鄣膬炔堪l育與外部形態間有一定的穩定關系，而確定花粉的發育時期對于取材用于不育相關基因的研究將十分重要。到目前為止，未見系統出現從陸地棉‘洞A的花蕾外部形態指標來判斷不育株花粉的發育時期的文獻。筆者旨在確定‘洞A最重要敗育時期即小孢子單核早期（四分體期）與外部形態的對應關系，并提供圖片依據，進而可以準確、便捷地進行取材。同時對‘洞A花粉發育影響因素進行討論，為不育基因的研究提供方法和理論的參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

2011年在南寧市區試驗田對陸地棉‘洞A花粉的發育時期進行4次調查，4分體時期的花蕾直徑：8月31日，d=3～4 mm； 9月13日，d=3～4 mm；9月28日，d=4～5 mm；10月26日，d=4～5 mm。

1.2 方 法

1.2.1 取材 在花期分別標記不育株和可育株，分別摘取不同大小的不育株和可育株花蕾，速放置冰上，做到隨摘隨放。為了確定花蕾的外部形態和內部發育之間的關系，用千分尺量取花蕾最大直徑處，為了達到準確一致，采取千分尺與鈴柄平行的方式，直徑每隔1 mm取1次樣，直至成熟花粉。

1.2.2 光學顯微觀察 用鑷子在花蕾上形成丁字切口，剝開苞片，選取少量花蕾中間部分花藥，置于載玻片上，先用鑷子盡量夾碎，滴1滴蒸餾水，蓋上蓋玻片，用帶橡皮的鉛筆豎直敲打蓋玻片，使花藥壁破碎更加徹底，Leica DM-LB型光學顯微鏡下觀察拍照。

2 結果與分析

陸地棉‘洞A不育是受一對隱性基因（ms·ms）控制的，當一對基因均為ms（純合）時，植株表現為雄性不育；一對基因中其中一個為顯性基因Ms（雜合）時，植株表現為可育。親本繁育時，用可育株（Ms·ms）的花粉授于不育株（ms·ms）的花， 所產的種子來年種植后，可育株與不育株仍各為50% ，因一系兩用（不育系、保持系），故稱兩用系。從圖1可以看出，不育株花藥不開裂，花藥細小，柱頭較長；可育株花粉散開，較粗壯。

3 結論與討論

從以上細胞學研究的結果，歸納出‘洞A花粉發育時期與外部形態對應關系：花蕾直徑d=1～2 mm為減數分裂期；d=2～3 mm是4分體形成初期；d=3～4 mm處于4分體期；d=4～5 mm是雙核期；d=5 mm為花粉粒形成初期；d=6 mm是成熟花粉期。小孢子從4分體初期（小孢子單核早期）開始，出現明顯的敗育現象，如4分體間的橫隔消失、內容物減少、外泄，有的內容物全部消失等現象，致使發育停滯。即使可以進入下一階段，也不能發育成具有育性的花粉粒。說明小孢子單核早期是敗育的最主要和關鍵時期，此時期也是研究育性轉換關鍵基因的最佳時期。

郝天峰等[12]研究了‘洞A不育系的衍生系抗A1不育株為低溫不育、高溫可育，與光照關系不大。花粉量的多少與其開花前7～11 d和9～13 d的日平均溫度呈極顯著正相關關系，因此，初步認為其育性轉換的敏感期為開花前7～13 d。棉花核不育系抗A1育性轉換不育株后代，在處理溫度為25～26 ℃條件下，表現完全不育；27～28 ℃出現不育和半不育并存的現象；在29 ℃表現完全可育。從其結果可以看出，抗A1育性轉換的開關的不育株上，高溫就可以轉變成可育株。但從‘洞A在田間的表現來看，高溫時可育株的數量并沒有增加，只是低溫會使可育株育性降低。調取南寧市區4次調查前10 d的日平均氣溫，分別是：24.7，24.5，20.3，19.8 ℃。從結果可以看出，溫度在24.5 ℃以上的時候，對花粉發育沒有影響，可以按照筆者研究的結果進行取材。關于植物雄性不育花粉敗育過程前人早有評述，認為花粉敗育的形式和時期是多種多樣的，隨植物不同而異，敗育時期受遺傳和環境相互作用所制約。對于陸地棉不育系‘洞A育性轉化的條件還有待于進一步研究。

參考文獻：

[1] 唐雯，張相.棉花“洞A”型核雄性不育形態及機理研究現狀[J].安徽農業科學，2008，36（4）：1402-1404.

[2] 黃觀武，張東銘，茍云高，等.對我國陸地棉雄性不育基因的初步分析[J].四川農業科技，1982（2）：1-4.

[3] 張天真，馮義軍，潘家駒.我國發現的4個棉花核雄性不育系的遺傳分析[J].棉花學報，1992（4）：1-8.

[4] 胡磊.棉花核雄性不育基因ms_（14）及農藝性狀SSR分子標記定位的研究[D].烏魯木齊：新疆農業大學，2009.

[5] 侯磊，肖月華，李先碧，等.棉花洞A雄性不育系花藥發育的mRNA差別顯示[J].遺傳學報，2002，29 （4）：359-363.

[6] Kamalay J C， Goldberg R B.Organ-specific nuclear RNAs in tobacco[J]. Proc Natl Acad Sci， 1984，81（9）：2801-2805.

[7] Goldberg R B，Beals T P，Sanders P M.Anther development：Basic principles and practical applications[J].Plant Cell，1993，5（10）：1217-1229.

[8] Mascarenhas J P.Gene activity during pollen development[J]. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology，1990（41）：317-338.

[9] 湯澤生，杜素瓊，王祖秀，等.棉花“洞A”小孢子發育的細胞形態學研究補遺[J].南充師院學報：自然科學版，1982（2）：28-31.

[10] 湯澤生.棉花雄性不育論文集[M].成都：四川省科學技術出版社，1989.

[11] 湯澤生，王祖秀，徐林，等.棉花海洞不育系小孢子敗育的研究 [J].南充師院學報：自然科學版，1985（2）：1-3.

[12] 郝天峰，何覺民，郭宗學，等.花核不育系抗A1育性轉換不育株育性變化與溫度的關系[J].廣東農業科學，2007（3）：13-15.