花椰菜游離小孢子培養研究進展

邊立娜　牛國保　孫德嶺

摘 要：綜述了利用小孢子培養技術創新花椰菜種質資源的研究及進展、胚胎發生的影響因素及前景展望。

關鍵詞：花椰菜；小孢子培養；種質創新

中圖分類號：S635.3 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.06.002

花椰菜（Brassica oleracea var. botrytis L.）在我國栽培歷史較短，十九世紀中葉傳入我國南方，其種質資源是國家和人民的寶貴財富，是培育優良品種不可缺少的物質基礎，也是生物學理論研究的重要材料。隨著現代科學技術與我國蔬菜產業的發展，花椰菜種植面積快速增長，品種需求量急劇增加，從自然形成的品種中進行選育的方法已經遠遠不能滿足現代農業的需求。因此，加快花椰菜新品種選育、提高育種技術、創新種質資源是花椰菜育種工作的當務之急[1-3]。筆者僅就利用小孢子培養技術創新花椰菜種質資源的研究及進展作一簡單介紹。

1 創新花椰菜種質資源的重要性與迫切性

花椰菜種質資源系統性的整理、評價、鑒定工作在我國還處于初級階段，花椰菜育種研究薄弱，這是因為我國關于花椰菜的研究起步較晚，而且從事花椰菜育種研究的單位較少，研究力量薄弱，與其他蔬菜育種相比存在一定距離。

我國花椰菜種質資源主要集中分布在福建省、浙江省、廣東省及上海市，由于種植地比較集中，種質資源遺傳背景狹窄，花椰菜品種單一、品種間遺傳相似性高[1，4]。因此，在花椰菜育種工作中，創新種質資源，選育出適應不同栽培環境及市場需求的新品種是十分迫切的。

2 小孢子培養技術在花椰菜種質創新中的應用

小孢子培養技術應用于花椰菜種質創新的優越性體現在3個方面。

（1）可以得到高度純合、穩定的親本。游離小孢子培養是將花粉培育成單倍體植株，其染色體是自然或人工加倍得到純合二倍體的一種育種方法。這種染色體加倍產生的純合二倍體，在遺傳上非常穩定，不發生性狀分離，形成性狀穩定一致的近等基因系，為遺傳育種研究提供良好的育種材料[4-5]。同時，高純度的植株更便于遺傳分析、遺傳圖譜的構建和分子標記等基礎研究。

（2）應用這一技術，能縮短育種年限，加速育種進程。常規的親本獲得途徑是通過自花授粉和定向選擇，需經6～8代，時間長，花椰菜多為自交親和。而通過小孢子培養獲得穩定的材料，進一步用于育種實踐，大大縮短了育種年限[4]。

（3）可提高誘變育種的效率[5]。在誘變育種中，基因突變的機率很低，如果突變的是一個隱性基因，植株上不能直接表現出來，而以單倍體植物作誘變材料，突變隱性基因就可表現出來。所以利用單倍體植株的突變能夠篩選抗病、抗蟲、抗旱的高產花椰菜植株。

3 影響花椰菜小孢子胚胎發生因素的研究

3.1 不同花椰菜基因型對胚胎誘導的影響

基因型是影響小孢子培養的最關鍵因素。不同基因型植株在同樣的試驗條件下，小孢子培養的誘導頻率差異很大[6]。方淑桂等[7]在相同條件下利用80份供試材料的小孢子進行培養，只有20個產生胚狀體。趙前程等[8]對參試的186個試材進行小孢子培養，僅有55個材料得到了小孢子胚，出胚率為29.7%。張曉芬等[2]在對12個供試品種的試驗中也發現了基因型對胚胎誘導的關鍵作用。

3.2 供體植株小孢子胚發育階段

能否誘導小孢子發育成胚與小孢子發育階段息息相關。Sato等[9]研究指出，單核靠邊期和雙核早期是適宜小孢子培養的最佳時期。在與花椰菜同屬十字花科的大白菜游離小孢子培養中，單核后期是誘導小孢子胚胎發育的最佳時期[9]。方淑桂等[7]和星曉蓉[10]的研究結果都表明，在花椰菜小孢子培養中，只有單核晚期至雙核期的小孢子才能發育成胚狀體。此時花蕾長度為4.6～5.5 mm，此間產胚率最高，平均每蕾可產蕾約30個。而處于單核早期和三核期的小孢子一般不會膨大[7，11]。

3.3 花椰菜供體植株和花粉的生理狀態

受栽培環境、花期及其花蕾生理狀況的影響，誘導小孢子成胚率不同。在對十字花科作物的研究中，張鳳蘭等[12]利用人工氣候室研究了不同光照和溫度對小孢子胚胎發生的影響，結果表明： 日照時數為14 h、溫度在15～20 ℃最有利于小孢子胚的發生，此時產胚率最高。高溫短日照對小孢子最為不利。李浩杰等[13]在對甘藍類油菜小孢子培養研究中發現，晝夜溫差5 ℃左右時胚產量最高，溫度低于5 ℃或高于20 ℃胚產量都較低甚至不出胚。顧宏輝等[14]在對早熟花椰菜小孢子的研究中也發現，早熟花椰菜中，適宜小孢子胚胎發育的最佳時期較少，這與其生長環境可能存在一定關系。

3.4 高溫處理

高溫熱激預處理是促進細胞對稱分裂、改變小孢子發育方向的主要條件[15-17]。許多研究表明，甘藍類小孢子培養初期不經過高溫處理，培養無反應，而經過高溫處理的，因溫度和處理時間不同，胚產量高低也有差異。方淑桂等[7，11]對花椰菜游離小孢子的研究表明，33 ℃下處理48 h效果最好，產胚量明顯高于其他處理。趙前程等[8]對花椰菜小孢子高溫處理研究表明，32 ℃下，處理24 h效果最佳。

3.5 培養液對胚狀體發生的影響

NLN培養基是花椰菜游離小孢子培養的常用培養基。方淑桂等[7]在游離花椰菜小孢子培養過程中發現，培養基中19%蔗糖濃度下，小孢子存活率最高，而在13%蔗糖濃度下，誘導成胚率最高，因此，添加和更換培養液對胚狀體的影響非常重要。趙前程等[8]研究表明，在培養基中添加6-BA 0.1 mg·L-1和NAA 0.005 mg·L-1的激素組合，能促進小孢子胚狀體的發育，形成球型胚的發生頻率最高。

3.6 不同日齡對胚狀體的影響

花椰菜小孢子胚狀體發育比較緩慢，離體培養20 d后，發育成球型胚，此時應將胚狀體轉移到脫分化培養基上，誘導出愈傷組織后再進行誘導分化，就能夠獲得高效率的植株再生。趙前程等[8]試驗表明，不同日齡的胚狀體進行脫分化處理的成活率不同，20 d的胚狀體成活率最高。

4 培養技術

4.1 分離小孢子的方法

目前分離小孢子的方法有兩種：（1）自然散落法。即將處于小孢子成胚發育最佳時期的花蕾清洗消毒后，在無菌的條件下，取出花藥，接種在培養基上，任其花粉散落。（2）機械擠壓法。將用酒精和次氯酸鈉消毒后的花蕾置于研缽中，用研磨棒將花粉擠壓出來，用尼龍網過濾，再用B5培養基沖洗，經過多次離心，得到游離小孢子[18-19]。

4.2 培養基及其附加物

在花椰菜小孢子培養中，一般采用蔗糖濃度為13%的NLN培養基，趙前程等[8]研究表明，在培養基中添加6-BA 0.1 mg·L-1和NAA 0.005 mg·L-1的激素組合，能促進小孢子胚狀體的發育，形成球型胚的發生頻率最高。小孢子在發育過程中，會釋放有毒物質，這些有害物質會降低小孢子胚狀體的成活率。楊清等[19]報道，在冬花椰菜的小孢子培養過程中，加入0.5 g·L-1的活性炭能提高胚的發生率。Dais和Martins[20]在花椰菜小孢子培養過程中，加入AgNO3 能夠促進胚胎的形成。

4.3 高溫預處理

將培養基放置在高于正常溫度的條件下，進行熱激處理。一般認為33 ℃下預處理24 h，轉入24 ℃下培養，出胚率較高。此外，花粉密度對小孢子的培養也非常重要。Duijs[21]研究表明，小孢子密度為2×104～4×104個·mL-1最適合。

4.4 植株的再生

小孢子培養3 d左右將發生第一次分裂，2～3周后依次出現球型胚和心形胚，繼續培養，將出現子葉胚，轉移到分化培養基上發育成植株。經小孢子培養得到的是單倍體植株，經化學試劑如秋水仙素處理，或者田間自然加倍，可得到純合二倍體。而趙前程等[8]研究結果表明，在花椰菜小孢子的培養過程中，存在較高頻率的自然加倍，認為經花椰菜小孢子培養得到的再生植株，不需要進行人工加倍，其具有自然加倍成二倍體的特點，這一發現，使利用小孢子培養得到純和親本的育種工作變得更加快捷。

5 前景與展望

經過多年的研究探索，我國花椰菜游離小孢子培養技術逐漸完善，應用于育種工作取得重大突破與成功。但利用小孢子發育成胚狀體誘導率不高，添加適當的激素可以提高易出胚的產胚率，但是尚未找到促使難出胚材料出胚的激素配比[22]。關于小孢子培養的啟動機制、微觀發育機制、發育途徑以及與之相關的生理生化方面的理論研究僅在猜測和探究過程中[23]，基因型影響出胚率是毋庸置疑的，但如何克服這一困難，在分子與蛋白質水平上還有待研究，應該加強小孢子培養技術與細胞工程、基因工程等其他生物技術的結合[18]。不斷完善小孢子培養技術，同時探究其理論基礎，使這項技術能更好地為我們所利用。

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