斑馬魚一種母源凝集素基因zfol的原核表達和抗體制備分析

杜嫚　王紅瑩

摘 要：zfol是斑馬魚的一種母源凝集素基因。從斑馬魚胚胎中提取RNA，應用RT-PCR從斑馬魚中得到zfol的基因片段，重組入原核表達載體pEASY-E2中得到重組質粒，并測序鑒定其序列的正確性，將重組質粒轉化到大腸桿菌BL21中誘導表達，并純化蛋白，利用純化的重組蛋白為抗原免疫兔子，制備斑馬魚母源凝集素Zfol蛋白的多克隆抗體，利用Western-blot方法檢測抗體特異性，得到特異的多克隆抗體，為進一步研究母源凝集素基因zfol的功能奠定了基礎。

關鍵詞：斑馬魚；zfol；原核表達；多克隆抗體

中圖分類號 S965.299 文獻標識碼 B 文章編號 1007-7731（2013）06-14-03

免疫系統是機體執行免疫應答及免疫功能的一個重要系統，保衛機體免受疾病的危害，免疫系統以基本的免疫系統（以酶的形式存在于細菌中免受噬菌體感染）或者復雜的免疫系統（人體內）存在于所有生物體中。另外一些基本的免疫機制是從古老的真核生物演變而來，存在于后代生物中，例如植物和昆蟲，包括吞噬作用，抗菌類多肽如防衛素，以及補體系統[1-2]。大多數魚類在尚未發育完全時，其對外界病原微生物仍然具有一定的抵御能力，這種抵御能力主要來自于自身非特異性免疫和母源性免疫。而存在于卵母細胞中的凝集素、溶菌酶等物質被認為是來自于母體的免疫物質，并且在魚類胚胎發育中可能發揮重要作用[3]。目前對魚類胚胎發育早期的先天免疫機制的研究已經成為魚類免疫學研究的重點領域，主要是由于魚類在胚胎發育早期的致死率較高[4-5]。

斑馬魚作為新型模式生物，具有以下優點：成年魚個體小，易于飼養；胚胎體外發育，易于觀察和操作；品系資源豐富；發育快速、性成熟期短、繁殖力強，以利于提供充足的實驗材料；較完善的胚胎和遺傳學操作技術，如轉基因、基因過表達等技術。近年來隨著對斑馬魚研究的不斷深入，其應用范圍已經涵蓋魚類免疫系統發生、病原和宿主研究的各個方面[6-7]。筆者試圖通過構建母源凝集素zfol基因原核表達載體，制備多克隆抗體，并用此抗體檢測斑馬魚中該基因的表達，為進一步研究該基因的功能提供條件，也為深入研究母源凝集素基因在魚類胚胎發育早期的免疫保護作用中扮演的角色奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 斑馬魚（Danio rerio），選取生命力旺盛，具有活躍繁殖力的適齡斑馬魚，由中國海洋大學分子醫學生物學實驗室提供。

1.2 酶及相關試劑 限制性內切酶購自NEB；T4連接酶購自Promega；膠回收、質粒提取等相關試劑盒購自TaKaRa；RNA提取試劑盒購自Fastagen公司；His Bind Purification kit購自Novagen公司；弗氏佐劑購自Sigma公司；DMEM購自Gibco公司。

1.3 菌株及質粒 大腸桿菌BL-21由本實驗室保存；原核表達載體pEASY-E2由中國海洋大學分子醫學生物學實驗室提供。

1.4 方法

1.4.1 引物設計 5引物（5-GGGAATTCCATATGGACTGTACTATAATGAATGG-3），3引物（5-CCGCTCGAGCCGACTCACACCAACTCTTT-3），5引物中含有NdeI酶切位點CATATG，3引物中含有XhoI酶切位點CTGGAG，用于擴增得到zfol的目的基因片段。

1.4.2 總RNA的提取和目的片段的擴增 取斑馬魚早期胚胎數十枚，用RNA提取試劑盒提取總RNA，然后逆轉錄合成cDNA：（1）體系一：oligo dT 1μL，mRNA 2μg，加Rnase free ddw至13μL，70℃孵育5min；（2）體系二：逆轉錄酶1μL，buffer 5μL，dNTP 5μL，RNA酶抑制劑1μL；（3）體系一孵育完成后，將體系二加入其中，震蕩混勻，42℃孵育60min，然后70℃孵育15min。以cDNA為模板，進行PCR擴增，PCR反應條件：94℃預變性5min；94℃變性30s、58℃退火30s、72℃延伸45s，進行35個循環；72℃延伸10min。

1.4.3 原核表達質粒的構建及鑒定 zfol基因PCR擴增結束后，將PCR產物純化，用限制性內切酶NdeI和XhoI雙酶切，提取原核表達載體pEASY-E2質粒，同樣用限制性內切酶NdeI和XhoI雙酶切，酶切完成后，回收酶切產物，將zfol基因片段與表達載體pEASY-E2用T4連接酶連接起來，轉化感受態細胞DH5α，測序鑒定出序列正確的克隆。

1.4.4 重組質粒在大腸桿菌中的表達和純化 選取測序無誤的克隆，提質粒轉化大腸桿菌BL21，挑單克隆并培養至OD600≈0.5，加入終濃度為1mmol的IPTG，37℃條件下誘導4h后離心并收集菌體，4℃、12 000g離心1min，離心棄上清，將菌體沉淀重懸于100μL 2×上樣緩沖液（100mmol/L Tris，pH6.8，200mmol/LDTT，0.2%溴酚藍，20%甘油，4%SDS）。菌懸液沸水浴煮5min，立即冰浴2min，4℃離心5min，取20μL樣品上樣，進行SDS-PAGE電泳分析。用親和素-生物素親和層析純化原核表達載體表達的蛋白。

1.4.5 多克隆抗體的制備及特異性檢測 純化后的zfol蛋白與弗氏佐劑等體積混合乳化，對免疫動物日本大耳白兔的背部皮下多點注射。第1次注射2～3周后再加強免疫3次，各次劑量為第1次注射的1/4，每次間隔10d，后3次以弗式不完全佐劑乳化樣品。在第4次注射后10d經心臟取血，按常規方法分離血清。取未經IPTG誘導和經IPTG誘導的重組質粒的菌體總蛋白進行Western-blot檢測抗體的特異性，SDS-PAGE電泳分離。電泳結束之后，切下含有目的蛋白的PAGE膠，通過電轉印將蛋白轉移到PVDF膜上，轉好的膜經TBS洗滌后，在5%的脫脂奶粉中封閉至少2h；將封閉好的膜用TBST洗滌后，加一抗孵育，zfol多克隆抗體為一抗（1：200稀釋），4℃搖床孵育過夜；TBST洗膜5min×4次，加二抗（羊抗兔1：1 000）孵育至少2h；TBST洗膜5min×4次，然后用ECL顯色液顯色，用凝膠掃描分析系統掃描存圖，并用分析軟件GENETOOL分析結果。

2 結果與分析

2.1 總RNA提取和zfol的擴增 取斑馬魚早期胚胎30枚左右，用RNA提取試劑盒提取總RNA，用于反轉錄合成第一鏈cDNA，從圖1（A）中可看出28S、18S和5.8S 3條RNA帶型，提取的RNA能夠用于反轉錄合成cDNA，然后以cDNA為模板，用設計好的引物擴增zfol基因片段，zfol基因cDNA全長為771bp，所擴增zfol的基因片段長度為579bp，從圖1（B）可以看出，擴增大小在預期片段大小范圍內。

2.2 原核表達質粒的構建與鑒定 將zfol基因擴增后的片段經處理后，連接到表達載體中，用融合蛋白的形式表達。通過測序驗證所構建的原核表達質粒是否正確，圖2中的測序結果與zfol基因序列比對，結果一致。

2.3 zfol多克隆抗體的制備和特異性分析 用Western免疫印跡檢測抗血清的特異性。結果顯示，以未經IPTG誘導的重組質粒的菌體蛋白作對照，沒有信號，而經IPTG誘導的重組質粒的菌體蛋白能夠檢測到信號，抗體能特異地識別28kD的zfol蛋白（圖3）。

3 結論與討論

凝集素在低等脊椎動物和無脊椎動物中是種重要的免疫介質，并且它們能夠結合碳水化合物，這些碳水化合物涉及到對細胞壁的附著，因此，凝集素能阻止這種附著作用及隨后的入侵。對凝集素在早期胚胎發育中免疫保護作用的深入研究，有利于降低魚類在早期胚胎發育時期的死亡率。zfol作為斑馬魚的一種母源凝集素基因，有可能在早期胚胎發育過程中發揮免疫保護作用。在本研究中，筆者原核表達了從斑馬魚中鑒定出來的一種母源凝集素基因zfol，并成功制備了多克隆抗體。該多克隆抗體的制得為進一步研究zfol在斑馬魚胚胎發育早期中發揮的重要作用奠定了基礎。

參考文獻

[1]Pradipta R. Rauta，Bismita Nayak，Surajit Das. Immune system and immune responses in fish and their role in comparative immunity study： A model for higher organisms[J]. Immunology Letters，2012（148）：23-33.

[2]Beck G，Gail SH.Immunity and the invertebrates[J]. Sci Am，2007，60：6.

[3]王志平. 斑馬魚（Danio rerio）母源性補體因子的傳遞和免疫功能以及補體系統的個體發育[D]. 青島：中國海洋大學，2008.

[4]Bergljot Magnadottir. Innate immunity of fish （overview）[J]. Fish & Shellfish Immunology，2006，20：137-151.

[5]P. Swain，S.K. Nayak.Role of maternally derived immunity in fish[J].Fish & Shellfish Immunology，2009，27：89-99.

[6]John F. Rawls，Michael A. Mahowald， Andrew L. Goodman，et al. In vivo imaging and genetic analysis link bacterial motility and symbiosis in the zebrafish gut[J]. PNAS May1，2007，18：7 622-7 627.

[7]孫智慧，賈順姬，孟安明. 斑馬魚：在生命科學中暢游[J]. 生命科學，2006，18：431-436.

（責編：徐世紅）