庫拉索蘆薈組織培養褐化現象的抑制研究

代建麗　宋嬋嬋　徐晨等

摘 要：褐化是蘆薈組織培養中的普遍現象，嚴重影響組織培養的效果。以庫拉索蘆薈的莖段和葉片為外植體，研究了5種防褐劑活性炭、硝酸銀、維生素C、L-谷氨酰胺和聚乙烯吡咯烷酮對愈傷組織誘導中褐化現象的抑制作用。結果表明，5種防褐劑都具有抑制外植體褐化的作用，其中15mg/L的AgNO3是最合適的防褐劑，其外植體褐化程度最輕，愈傷組織誘導率較高且愈傷組織生長良好。

關鍵詞：庫拉索蘆薈；愈傷組織；褐化；防褐劑

中圖分類號 Q949.71+8.23 文獻標識碼 B 文章編號 1007-7731（2013）06-23-02

庫拉索蘆薈（Aloe barbadensis）為百合科蘆薈屬多年生肉質植物[1]，其葉肥厚多汁，富含多種活性物質和營養元素，如維生素、多糖、蒽醌類化合物，葉肉粘膠物質占總葉重的65%～75%，3a以上老葉藥效成分含量高，是藥用、保健、美容的主要品種。庫拉索蘆薈的常規繁殖速度慢，主要利用組織培養技術進行快速繁殖，目前已經開展了一些研究[1-7]。研究的結果表明，莖尖和莖段更容易產生不定芽，葉片外植體難以誘導分化，但是所有的外植體在組織培養中都會發生褐化現象，嚴重時可導致外植體或分化的組織器官死亡[4-7]。褐化影響培養物的生長，不利于后期次生產物積累的研究和種苗的快速繁殖。筆者在培養基中添加了不同的防褐劑[6-9]，探討防止外植體褐化的有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料 3a生庫拉索蘆薈，購于武漢雄楚大街花卉市場。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 取庫拉索蘆薈的莖和葉片在自來水下沖洗干凈。選擇幼嫩葉片拋開晾2h，然后在無菌條件下用75%的酒精消毒30s，0.1%升汞處理10min，無菌水洗滌5～6次，切成約0.5cm×0.5cm的小片，接種到培養基上進行培養。鱗莖用75%的酒精消毒30s，0.1%升汞處理15min，無菌水洗滌5～6次，切成約0.5cm×0.5cm×0.3cm的小塊，接種到培養基上進行培養。

1.2.2 庫拉索蘆薈愈傷組織誘導培養基的篩選 以MS為基本培養基，采用4因素3水平的正交設計，其中KT設置1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L 3個水平，2，4-D設置0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L 3個水平，NAA設置0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L 3個水平，6-BA設置1.0mg/L、3.0mg/L、5.0mg/L 3個水平，培養基中添加2g/L活性炭抑制褐化。將消毒后的莖和葉片外植體接種到培養基上，每瓶接種3個外植體，每處理3瓶。暗培養4d后24℃光照培養，2周后統計愈傷組織的誘導情況，連續統計3周，以最適培養基進行防褐化實驗。

1.2.3 防褐化實驗 以1.2.2的實驗結果為參考，在MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.3mg/L的愈傷組織誘導培養基中，分別加入2g/L活性炭、15mg/L硝酸銀、0.2g/L維生素C（VC）、5mg/L L-谷氨酰胺、1.5g/L聚乙烯吡咯烷酮（PVP），組成5個防褐化處理，另設一組不加防褐化劑的空白對照，共6個處理。將消毒后的莖和葉片外植體接種到培養基上，每瓶接種4個外植體，每處理3瓶。低溫8℃暗培養4d后，24℃暗培養3d，然后24℃弱光培養。每天觀察外植體生長狀態，2周后統計外植體的褐化情況及愈傷組織誘導率，連續統計2周。

2 結果與分析

將外植體接種到含有不同防褐化劑的培養基上培養，6d后外植體體積顯著增大，除葉外植體的AgNO3處理外，其他處理均出現了褐化現象，褐化程度不一，以空白對照的褐化程度最為嚴重，莖外植體的褐化程度顯著高于對應的葉外植體。轉入弱光培養1周后，外植體色澤更綠而有光澤，4周漸漸有顆粒狀愈傷組織形成，外植體轉為黃綠色。3周時愈傷組織繼續生長，4周時各處理的愈傷組織誘導率及褐化情況見表1和表2。

從表1和表2可以看出，在培養基中加入不同的附加物都可以有效抑制外植體的褐化，葉的褐化程度較莖輕。葉外植體的5種處理中，VC處理的愈傷組織誘導率最高，但外植體褐化率較高，導致形成的愈傷組織體積小；AgNO3和谷氨酰胺處理的外植體褐化率降低，愈傷組織誘導率處于中等水平，但AgNO3處理的愈傷組織生長迅速；活性炭和PVP處理的愈傷組織誘導率較低。綜合各項指標，AgNO3是最合適的防褐化劑。莖外植體的5種處理中，VC處理的愈傷組織誘導率最高，愈傷生長狀態較好，但外植體褐化率較高；AgNO3處理的外植體褐化率降低，褐化程度輕，愈傷組織生長迅速但愈傷組織誘導率較低；谷氨酰胺處理的外植體褐化率低，愈傷組織誘導率高，但愈傷組織體積小。綜合各項指標，VC和AgNO3都是較適合的防褐化劑。

3 討論

庫拉索蘆薈由于含有蒽醌類物質在培養中容易出現褐化現象。實驗中加入的5種防褐化劑都可以減輕外植體的褐化，但效果不同，這是因為它們的作用機理不同。VC、AgNO3、L-谷氨酰胺屬于抗氧化劑，其通過降低蘆薈大黃酚等物質的氧化達到防褐化效果，而活性炭和PVP是吸附劑，是通過吸附蒽醌類物質達到防褐化效果。吸附劑在吸附褐化物質的同時，也可吸附培養基中的營養物質如激素，所以吸附劑的作用效果比抗氧化劑差。3種抗氧化劑中，VC和L-谷氨酰胺屬于生物活性物質，AgNO3是重金屬，所以AgNO3的防褐化效果雖好，但同時抑制了愈傷組織的形成，其愈傷組織誘導率均低于VC和L-谷氨酰胺。由于次生產物的提取和種苗的克隆需要大量生長狀態良好的愈傷組織，培養中愈傷組織的褐化程度將是最關鍵的指標，愈傷組織誘導則可以通過擴大初代培養外植體的數目加以改善，因此，AgNO3適合作為庫拉索蘆薈組織培養的防褐化劑。

參考文獻

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[9]蔡建榮. 山藥組織培養褐化反應的研究[J]. 中國農學通報，2008，24（8）：118-120. （責編：徐世紅）