陳化煙葉表面可培養寡營養菌多樣性分析

何家亨等

摘要：通過低濃度營養培養基分離4種不同陳化煙葉表面的微生物，經過連續2～4周的培養，共獲得55株不同的菌株，通過16S rDNA擴增和測序進行初步的分子鑒定后，進行BLAST比對分析，挑選每個菌株最大一致性的同源菌株16S rDNA序列一起進行系統聚類分析。結果表明， 陳化煙葉中微生物存在著廣泛的多樣性，每種煙草中都擁有自己獨特的微生物菌群，存在大量的兼性寡營養菌，專性寡營養菌較少，而且煙葉的品種和等級直接影響到微生物的種群和數量。

關鍵詞：陳化煙葉；寡營養菌；細菌多樣性；16 S rDNA序列；聚類分析

中圖分類號：TS41+4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）06-1292-06

煙葉在制成成煙之前需要經過漫長的陳化期，煙葉陳化是卷煙工業的一種初加工方法。當年收獲的新煙葉，其品質都存在不同程度的缺陷，不宜直接用于制造卷煙，必須進行陳化處理[1]。在陳化發酵過程中，煙葉主要化學成分發生變化，青、雜氣和刺激性大大減輕，香氣顯露，氣味醇和，色澤均勻并加深[2]。煙葉表面的微生物發酵作用，對煙葉的陳化起著重要的作用。新煙葉在經過漫長的陳化階段后，煙葉的品質進一步得到改善，有害物質的含量也隨著降低。這個時期一般需要2～3年，如何縮短這個時期一直是科研工作者的研究熱點[1，3-5]。

煙葉表面含有豐富的微生物已有大量研究報道，如Zhao等[6]通過非純培養的方法對多種不同陳化時期的煙葉表面微生物進行了研究，采用16S rDNA PCR-DGGE技術進行多樣性分析發現，早期陳化階段各種煙葉擁有相似的優勢微生物種群結構，主要有5種細菌，其中3種為未培養微生物。Huang等[7]通過RLFP 技術構建OTUs（Operational taxonomic units）克隆文庫比較陳化與非陳化煙葉細菌多樣性發現，在陳化的煙葉中存在大量的未培養微生物。韓錦峰等[8]通過對未發酵、自然陳化及人工發酵期間的烤煙葉面微生物進行分離、鑒定，并對不同發酵時期微生物進行動態研究，結果表明，未發酵烤煙葉面微生物數量最多，但是隨著自然陳化及人工發酵的進行，葉面微生物數量均逐漸減少，且以芽孢桿菌屬（Bacillus）和梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）為優勢種群。朱大恒等[9]研究也發現烤煙中以芽孢桿菌和梭狀芽孢桿菌為優勢種群。而且大量研究表明烤煙葉面微生物中，細菌占絕對優勢，放線菌和霉菌較少，細菌中以芽孢桿菌屬為優勢菌群，霉菌中以曲霉為優勢菌群。優良品種烤煙葉面微生物的數量較大，種類也較多。因此研究不同煙草表面的微生物多樣性具有重要意義。

寡營養菌概念提出時沒有特指哪一類的微生物[10]。直到1979年，Kuznetsov等[11]才提出了寡營養菌是特指那些第一次培養時可以在含碳濃度為1～15 mg/L培養基中生長的細菌，并把它分為兩類，一類為在寡營養和富營養條件下均能生長的細菌，稱為兼性寡營養菌；另一類為只能在寡營養培養基中生長的細菌，稱為專性寡營養菌。科研工作者現在已經從多種生境中分離到了寡營養菌，它廣泛存在于海洋、湖泊、河流、土壤甚至飲用水中。Arthur[12]指出了寡營養菌營養偏好的原因，Button等[13]則研究了它對營養物質利用的動力學機制，發現寡營養菌的米氏常數較低，對營養物質的親和力大于富營養菌，因而在寡營養條件下能夠獲得競爭優勢。國內關于寡營養菌的研究起步晚，報道得也少。潘惠霞等[14]通過分離新疆沙漠中寡營養菌并對其在防風固沙方面進行研究發現，一些寡營養菌產生的胞外多糖能夠對沙粒產生粘連作用。和振花等[15]對極地海水中寡營養菌多樣性進行了研究。

目前尚沒有研究煙葉中寡營養菌的報道，根據以往關于陳化煙葉表面微生物分離和多樣性的報道推測，在漫長的陳化過程中，尤其是對于煙草品質提升有關鍵作用的中后期，可利用的簡單營養物質幾乎消耗殆盡，大部分菌株死亡，只有寡營養菌株才有可能生長。隨著陳化時間的延長，煙草的等級就越高，品質就越好，最后起作用的主要是寡營養菌。因此，研究陳化煙葉中寡營養菌的多樣性，對于解釋傳統的陳化作用如何利用微生物來改善煙葉品質有著十分重要的意義。此次試驗嘗試利用寡營養培養基對陳化煙葉表面的可培養寡營養菌進行分離和多樣性研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 煙葉樣品 2010年的廣西百色烤煙K326 C3F等級，湖北恩施烤煙云85 C3F等級，湖北恩施烤煙云85 B3F等級，湖北宜昌馬里蘭煙馬里蘭1號中部一級。

1.1.2 培養基 DNG固體培養基：TSB 15 mg，去離子水100 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌30 min。DNG液體培養基：TSB 15 mg， Gellan agar 1.5 g，CaCl2溶液37.5 μmol/L，去離子水100 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌30 min。LB固體培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂粉15 g/L。

1.2 方法

1.2.1 材料的預處理 取適量的煙葉在無菌條件下剪碎，用100 mL去離子水浸泡10 min，在搖床上200 r/min振蕩20 min。利用無菌紗布過濾，取濾液，然后離心去上清，用1 mL無菌水重懸。

1.2.2 陳化煙葉中菌株的分離與篩選 取100 μL濾液進行10倍梯度稀釋，稀釋液涂布DNG固體平板，并用封口膜或者一次性PE手套密封，于25 ℃培養2～4周，每隔3 d觀察1次，將獲得的單菌落進行分區劃線進一步分離與純化。將已獲得純培養的菌株接種于LB固體培養基中，觀察菌落的生長狀態。

1.2.3 陳化煙葉中分離菌株的16S rDNA分子鑒定 提取已獲得純培養菌株的總DNA[16]，采用16S rDNA通用引物[17]進行PCR擴增，正向引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物為1492R： 5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。按如下條件進行PCR擴增：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，54 ℃、30 s，72 ℃、90 s，30個循環；72 ℃、7 min。PCR產物采用凝膠純化試劑盒純化，純化步驟參照試劑盒說明書進行。純化的PCR產物送上海桑尼生物科技有限公司進行測序，測序結果進行BLAST同源比對。

1.2.4 不同煙葉分離寡營養菌的系統聚類分析 將每種煙葉所分離寡營養菌的16S rDNA序列進行BLAST比對分析，挑選每個菌株最大一致性的同源菌株的16S rDNA序列一起利用軟件Clustal W 2.0和MEGA 5.1進行聚類分析，構建系統進化樹。

1.2.5 專性寡營養菌的鑒別 將篩選出的菌株再次在富營養培養基中培養，不能生長的為專性寡營養菌；能生長的菌株，為了排除污染的可能性，將可以生長的菌株進一步用寡營養培養基培養，能在寡營養培養基生長的為兼性寡營養菌。

2 結果與分析

2.1 廣西百色烤煙K326 C3F等級可培養寡營養菌的分離與16S rDNA系統進化分析

通過利用寡營養和長期培養的方法，從該煙葉中共分離出12株菌株，具體見表1。利用Clustal W 2.0和MEGA 5.1進行聚類分析，構建系統進化樹如圖1所示。從圖1可以看出，在C3F等級陳化煙葉中一共存在10個菌屬，它們分別為泛菌屬（Pantoea）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、微桿菌屬（Microbacterium）、古氏庫特菌屬（Kurthia gibsonii）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、副球菌屬（Paracoccus）、法氏沃氏菌屬（Wautersiella falsenii）、微小桿菌屬（Exiguobacterium）、微球菌屬（Micrococcus）和類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）。通過1.2.5的方法發現菌株C3F18只能在寡營養培養基生長，由此可以看出在此種陳化煙葉中只有C3F18為可培養的專性寡營養菌，其他菌株均為兼性寡營養菌株。

2.2 湖北恩施烤煙云85 C3F等級可培養寡營養菌的分離與16S rDNA系統進化分析

通過利用寡營養和長期培養的方法，從該煙葉中共分離出10株菌株，具體見表2。利用Clustal W 2.0和MEGA 5.1進行聚類分析，構建系統進化樹如圖2所示。從圖2可以看出，在恩施云85 C3F等級陳化煙葉中一共存在7個菌屬，分別為假單胞菌屬、古氏庫特菌屬、微小桿菌屬、微球菌屬、類芽孢桿菌屬、不動桿菌屬和芽孢桿菌屬。C3FN7和C3FN18只能在寡營養培養基中生長，由此可以看出在此種陳化煙葉中只有C3FN7和C3FN18為可培養的專性寡營養菌，其他的菌株均為兼性寡營養菌株。

2.3 湖北恩施烤煙云85 B3F等級可培養寡營養菌的分離與16S rDNA系統進化分析

通過利用寡營養和長期培養的方法，從該煙葉中共分離出15株菌株，具體見表3。利用Clustal W 2.0和MEGA 5.1進行聚類分析，構建系統進化樹如圖3所示。從圖3可以看出，該種陳化煙葉中一共存在10個屬，分別為副球菌屬、微球菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬、腸桿菌屬（Enterobacter）、節桿菌屬（Brevibacterium）、歐文氏菌屬（Erwinia）、蓋球菌屬（Kytococcus）、短小芽孢桿菌屬（Bacillus pumilus）以及泛菌屬。分離的菌株都能在富營養培養基上生長，可見從此種煙草中分離的均為兼性寡營養菌。

2.4 湖北宜昌馬里蘭煙馬里蘭1號中部一級可培養寡營養菌的分離與16S rDNA系統進化分析

通過利用寡營養和長期培養的方法，從該煙葉中共分離出18株菌株，具體見表4。利用Clustal W 2.0和MEGA 5.1進行聚類分析，構建系統進化樹如圖4所示。從圖4進化樹中可以看出，該種陳化煙葉中一共存在10個屬，它們分別為假單胞菌屬、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、法氏沃氏菌屬、副球菌屬、微球菌屬、蓋球菌屬、考克氏菌屬（Kocuria）、鞘脂桿菌屬（Sphingobacterium）、類香菌屬（Myroides）。菌株M10和M32只能在寡營養培養基中生長，由此可以看出在此種陳化煙葉中有2種可培養的專性寡營養菌。

3 討論

由于寡營養菌獨特的生態功能，對于減少煙葉中有害物質，提高煙葉的經濟價值，增加煙農收入，改善煙草存儲條件，改善吸煙者的健康狀況都有重要的意義。通過分離這4種煙葉的寡營養菌，結合煙葉本身的特色，發現微生物的多樣性和煙葉的品種和質量有一定的內在聯系，例如湖北恩施烤煙云85中的B3F和C3F兩個等級煙葉中的Kytococcus schroeteri和Bacillus pumilus以及Enterobacteriaceae bacterium為湖北恩施烤煙云85中獨特的微生物，又因為B3F的物質含量多些，對應的微生物種類也相應多些。而4種煙葉中由于馬里蘭煙葉與其他烤煙煙葉有著明顯不同，微生物種類一是數量上多于其他三類，種類上也和其他三類差異很大，這一是因為馬里蘭煙葉本身的香氣物質不一樣，物質種類有差異，物質分解后產物也有差異，二是馬里蘭煙葉在涼棚中晾制，產生微生物也會更多。

參考文獻：

[1] 湯朝起，許建銘，張 俊，等.煙葉自然陳化研究進展及設想[J].中國煙草科學，1999，20（3）：17-19.

[2] 周冀衡，朱小平，王彥亭，等. 煙草生理與生物化學[M].合肥：中國科學技術大學出版社，1996.463-487.

[3] 劉維涓，楊偉祖，包德修，等.高壓靜電場用于煙葉陳化處理的研究[J].中國煙草科學，2003，24（1）：11-14.

[4] 錢 衛，田 敏，李麗莉，等.烤煙葉面微生物5種水解酶的產生、溫度穩定性及其在煙葉人工陳化中的應用[J].山東大學學報（理學版），2006，41（5）：155-160.

[5] 張俊松，徐玉瓊，張常記，等.超高壓條件下煙葉含水率對香味成分的影響[J].中國煙草科學，2008，29（6）：24-29.

[6] ZHAO M Q， WANG B X， LI F X， et al. Analysis of bacterial communities on aging flue-cured tobacco leaves by 16S rDNA PCR-DGGE technology [J]. Appl Microbiol Biotechnol， 2007，73：1435-1440.

[7] HUANG J W， YANG J K， DUAN Y Q， et al. Bacterial diversities on unaged and aging flue-cured tobacco leaves estimated by 16S rRNA sequence analysis[J]. Appl Microbiol Biotechnol， 2010，88：553-562.

[8] 韓錦峰，朱大恒，劉衛群，等.陳化發酵期間烤煙葉面微生物活性及其應用研究[J].中國煙草科學，1997，18（4）：13-14.

[9] 朱大恒，陳 銳，陳再根，等.烤煙自然醇化與人工發酵過程中微生物變化及其與酶活性關系的研究[J].中國煙草學報，2001， 7（2）：26-30.

[10] VAL H S， SAMANTHA B J， ROBERT W H. Eutrophication of freshwater and marine ecosystems[J]. Limnol Oceanogr，2006，51（1）：351-355.

[11] KUZNETSOV S I， DUBINIA G A， LAPTEVA N A. Biology of oligotrophic bacteria [J]. Ann Rev Microbiol，1979，33 （3）：377-387.

[12] ARTHUR L K. Oligotrophs and copiotrophs[J]. Bioessays，2001，23（7）：657-661.

[13] BUTTON D K， SCHUT F， QUANG P， et al. Viability and isolation of marine bacteria by dilution culture： Theory， procedures and initial results[J]. Appl Environ Microbiol， 1993， 59（1）：881-891.

[14] 潘惠霞，程爭鳴，張雪梅，等.干旱荒漠區寡營養細菌及其生態特性的研究[J].中國科學D輯：地球科學，2006，36（增刊II）：119-125.

[15] 和振花，楊季芳，陳吉剛，等.北極海水中可培養寡營養細菌多樣性[J].海洋湖沼通報，2011（4）：58-67.

[16] MILLER D N，BRYANT J E，MADSEN E L，et al.Evaluation and optimization of DNA extraction and purification procedures for soil and sediment samples[J]. Appl Environ Microbi，1999，65：4715-4724.

[17] LANE D J. 16S/23S rRNA sequencing[A].STACKEBRANDT E， GOOD F M. Nucleic acid techniques in bacterial systematic[C].Chichester：Wiley，1991.115-175.