亮菌產漆酶的液體和固體發酵條件優化

葉選怡等

摘要：為了探討液體和固體發酵條件對亮菌（Armillariella tabescens）產漆酶的影響，采用正交試驗對亮菌液體和固體發酵產漆酶培養基和培養條件進行篩選。供試亮菌在液體培養時產漆酶甚微，在培養基和培養條件優化后最高酶活為7.92 U/mL；固體發酵時在以葡萄糖濃度0.6%、稻草麥麩質量比3∶7、溫度27 ℃、含水量65%、接種量11 mL/100 g培養時漆酶酶活可達3 496.7 U/g。固體發酵的酶活顯著高于液體發酵，固體發酵更適宜亮菌產漆酶。

關鍵詞：亮菌（Armillariella tabescens）；漆酶；液體發酵；固體發酵

中圖分類號：TQ925 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）06-1410-05

漆酶（Laccase，EC1.10.3.2）是一種含銅的多酚氧化酶，與抗壞血酸氧化酶、血漿銅藍蛋白和胞外膽紅素氧化酶同屬于銅藍氧化酶（Blue multicupper oxidase）家族[1，2]。1883年，日本學者吉田（Yoshida）[3]首次從日本漆樹（Rhus verniciflua）樹汁中發現了一種可以使樹漆迅速氧化、硬化的酶；1894年，這種酶被分離純化，并被命名為漆酶[4]。多年來的研究證明，漆酶在自然界中分布于多種植物、真菌、少數昆蟲和細菌中，尤其在白腐真菌系統中分布更為廣泛，現已成為研究的熱點。漆酶具有的獨特功能使其具有巨大的生物利用潛能，如紙漿的去木質化、染料脫色、廢水脫毒、食品加工和制藥等[5]。

亮菌（Armillariella tabescens）又名假蜜環菌，因由柳樹發光朽木分離出菌種，菌絲體在暗處有熒光，故稱亮菌[6]。亮菌中含有亮菌甲素、乙素、丙素、氨基酸、多糖等多種化學成分。民間用亮菌治療膽囊炎和傳染性肝炎有顯著效果，現代藥理研究表明亮菌具有醒酒[7]、保肝[8]、防輻射[9]、增強免疫[10]和抗腫瘤[11]等多種功效。為此，在前期工作的基礎上，以漆酶酶活為檢測指標，對亮菌液體發酵和固體發酵產漆酶的條件進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 亮菌（Armillariella tabescens）菌種由中國普通微生物菌種保藏管理中心提供，培養保存于浙江醫藥高等專科學校實驗室。

1.1.2 主要試劑 ABTS[2，2′-聯氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽]購自美國Sigma公司，愈創木酚購自上海晶純試劑有限公司，其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 儀器與設備 TU-1810SPC型紫外可見分光光度計購自北京普析通用儀器有限公司，Biofuge Stratos冷凍離心機購自德國賀利氏公司，PHS-3C型pH計購自上海精科儀器有限公司，BCM-1000型生物凈化工作臺購自蘇州凈化設備有限公司，SPX智能型生化培養箱購自寧波江南儀器廠，BS124S型電子天平購自賽多利斯科學儀器有限公司，HH-2型恒溫水浴鍋購自國華電器有限公司，BSD-226SK型冰箱購自青島海爾股份有限公司。

1.1.4 培養基 綜合PDA固體培養基（%）：葡萄糖2.0、瓊脂粉1.8、土豆汁20、MgSO4·7H2O 0.15、KH2PO4 0.3、VB1 0.005；液體種子培養基（1 L）：葡萄糖20 g、蛋白胨15 g、KH2PO4 5 g、MgSO4·7H2O 1 g、（NH4）2SO4 5 g、玉米粉20 g、pH 6.0；液體發酵正交試驗培養基（1 L）[12]：小分子碳源、高分子碳源、無機氮源、有機氮源、CaCl2 1 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 1 g、VB1 0.05 g、吐溫-80 0.5 mL、微量元素8 mL、pH 6.0；液體發酵培養基微量元素（1L）：MnSO4·2H2O 0.5 g、NaCl 1 g、FeSO4·7H2O 0.1 g、ZnSO4·7H2O 0.1 g、CuSO4·5H2O 0.1 g、H3BO3 0.01 g；固體發酵正交試驗培養基（%）：葡萄糖、碳源、氮源、水、（NH4）2SO4 0.5、CuSO4 0.03、CaCl2 0.47、KH2PO4 0.5、MgSO4 0.2、 VB1 0.005、pH 6.0。

1.2 方法

1.2.1 培養方法

1）斜面及平皿菌種培養。在無菌條件下接種斜面和平皿培養基，于26 ℃避光培養7 d，于4 ℃冰箱保存，備用。

2）種子液培養條件。250 mL三角瓶裝100 mL種子液培養基，在無菌條件下用打孔器（直徑0.5 cm）量取2塊平皿培養基的菌絲塊接種至種子液中，置于27 ℃搖床以120 r/min避光培養7 d。

3）液體發酵培養條件。將種子液按6%的體積比轉接，培養條件除試驗特定其余均與種子液培養條件相同，所有試驗均重復3次。

4）固體發酵正交試驗培養條件。將種子液按一定的體積質量比轉接，在試驗條件下避光靜置30 d。

1.2.2 粗酶液的制備

1）液體發酵酶液的制備。從液體培養的第8天開始，每天定時取樣2 mL，在4 ℃、8 000 r/min下離心10 min，上清液即為粗酶液。

2）固體培養基酶液的制備。將固體培養基按質量比1∶1加入去離子水、搗碎培養料并攪拌均勻，放置于4 ℃冰箱中浸泡24 h，用八層紗布過濾，然后將濾液于4 ℃、8 000 r/min下離心10 min，上清液即為粗酶液，于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.3 漆酶酶活的測定 4 mL反應體系中含0.5 mmol/L的ABTS（反應底物）、0.1 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.0）、1 mL稀釋的粗酶液，于35 ℃反應5 min，在波長420 nm處測吸光度，取吸光度變化的線性部分。酶活定義：在一定條件下，每分鐘催化1 μmol ABTS氧化所需的酶量為一個酶活單位，單位為U。酶活=△OD420 nm×稀釋倍數×4 mL×106/（1 mL×△t×ε×1 cm）（ε為消光系數，ε=3.6×104 cm/（L·mol）。

1.2.4 亮菌產漆酶的液體發酵工藝

1）不同培養基組合對亮菌產漆酶的影響。對不同碳源和氮源組合進行L16（45）正交試驗，試驗因素與水平見表1，培養完成后測定亮菌漆酶酶活，分析不同培養基組合對亮菌產漆酶的影響。

2）不同培養基濃度對亮菌產漆酶的影響。在上一步試驗得到的最優培養基組合基礎上對培養基不同濃度進行L16（45）正交試驗，試驗因素與水平見表2。發酵完成后測漆酶酶活，分析不同培養基濃度對亮菌產漆酶的影響。

3）不同培養條件對亮菌產漆酶的影響。在優化培養基前提下分別對裝液量、接種量、菌齡和培養時間進行L9（34）正交試驗，試驗因素與水平見表3。發酵結束后測漆酶酶活，分析不同培養條件對亮菌產漆酶的影響。

4）不同誘導劑對亮菌產漆酶的影響。在以上最佳培養基和培養條件下進行亮菌產漆酶誘導試驗。試驗設計4組，分別加入0.5 mmol/L愈創木酚、0.5 mmol/L吐溫-80、0.5 mmol/L苯酚、0.2 g/L CuSO4作誘導產漆酶試驗，平行試驗3組，分析不同誘導劑對亮菌產漆酶的影響。

1.2.5 亮菌產漆酶固體發酵正交試驗 選擇葡萄糖濃度、稻草∶麥麩（m/m，下同）、溫度、含水量、接種量5個因素進行L16（45）正交試驗，試驗因素與水平見表4。發酵完成后測定漆酶酶活，分析不同培養基及發酵條件對亮菌固體發酵產漆酶的影響。

2 結果與分析

2.1 亮菌產漆酶液體發酵結果

2.1.1 不同培養基組合對亮菌產漆酶的影響 碳源和氮源是影響亮菌菌絲生長和代謝的重要因素，也是合成漆酶的重要原料。試驗分別以小分子碳源葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，高分子碳源淀粉、玉米粉、麥麩，無機氮源硫酸銨、氯化銨、硝酸銨，有機氮源酵母浸膏、蛋白胨、黃豆粉組合為不同碳源和氮源，測定不同培養基組合對亮菌產漆酶的影響。試驗取第10天發酵液的酶活進行分析，結果表明，極差為有機氮源﹥無機氮源﹥小分子碳源﹥高分子碳源，有機氮源是影響亮菌漆酶酶活的關鍵因素，其他3個因素也有一定的影響。由圖1可知，該菌發酵產漆酶的最適條件組合為A1B1C1D1，即最適小分子碳源為葡萄糖，最適高分子碳源為淀粉，最適有機氮源為酵母浸膏，最適無機氮源為硫酸銨，該條件下產生的漆酶酶活為2.05 U/mL，較其他酶活不足1 U/mL的狀況有顯著提高。

2.1.2 不同培養基濃度對亮菌產漆酶的影響 在上一步試驗得到的最優培養基組合基礎上對培養基不同濃度進行正交試驗，并取第10天酶液酶活進行極差分析。結果表明，極差為酵母浸膏濃度﹥硫酸銨濃度>葡萄糖濃度>淀粉濃度，酵母浸膏濃度是影響亮菌產漆酶的關鍵因素。由圖2可知，亮菌漆酶酶活最高的濃度組合是A2B2C2D2或A2B4C2D2，進行補充試驗比較，結果表明A2B2C2D2組合酶活較高，即在濃度組合葡萄糖5 g/L、淀粉15 g/L、硫酸銨2 g/L、酵母浸膏15 g/L下，亮菌漆酶酶活達4.97 U/mL。

2.1.3 不同培養條件對亮菌產漆酶的影響 在優化培養基的前提下分別對裝液量、接種量、菌齡和培養時間進行正交試驗，并對其結果進行極差分析。結果表明，極差為菌齡﹥接種量﹥培養時間﹥裝液量，菌齡是影響亮菌產漆酶最重要的因素。由圖3可知，亮菌液體發酵產漆酶的最優條件組合是A2B2C2D2，對該組合進行補充試驗，結果表明，該組合是亮菌產漆酶的最優條件組合，即在裝液量75 mL、接種量6%、菌齡7 d、培養時間10 d的條件下，亮菌漆酶酶活最優，達5.35 U/mL。

2.1.4 不同誘導劑對亮菌產漆酶的影響 在前面最佳培養基和培養條件下進行亮菌產漆酶誘導試驗，以未添加誘導物的培養基作為空白對照，結果見表5。由表5可知，以愈創木酚為誘導劑時，酶活提高到1.480倍，吐溫-80和CuSO4組幾乎未變，苯酚組酶活相對減弱。總體上，誘導劑的加入使亮菌產漆酶并未大幅度地提高。

2.1.5 4次試驗結果的比較 將亮菌液體發酵優化試驗依次表示為試驗1、試驗2、試驗3、試驗4，并對各步最優漆酶酶活進行比較，結果見圖4。由圖4可知，漆酶酶活隨著發酵條件的改善逐步提高，但最高酶活仍不理想。

2.2 亮菌產漆酶固體發酵正交試驗結果

選擇葡萄糖濃度、稻草∶麥麩、溫度、含水量、接種量5個因素進行正交試驗，并對其結果進行極差分析。結果表明，極差由大到小為稻草∶麥麩﹥接種量﹥含水量﹥葡萄糖濃度﹥溫度，稻草∶麥麩是影響亮菌產漆酶的重要因素。由圖5可知，最佳組合是A3B4C3D3E3。對該組合進行補充試驗，結果表明，該組合是最優發酵產漆酶組合，即葡萄糖濃度0.6%、稻草∶麥麩3∶7、溫度27 ℃、含水量65%、接種量11 mL/100 g，其他條件不變的情況下亮菌漆酶酶活可達3 496.7 U/g，比其他組合的最好酶活高出約1.7倍。

3 討論

真菌發酵篩選優化培養基和培養條件的方法很多，如單因素試驗、均勻試驗、正交設計等。由于本試驗亮菌發酵產漆酶的培養基和培養條件因素多，因素間的組合比較復雜，利用正交設計“均勻分散性和整齊可比性”的優點，可以更準確高效地篩選出最優發酵因素和組合。

3.1 漆酶的亮菌液體發酵生產

微生物培養基碳氮源一般由小分子碳源、高分子碳源、無機氮源和有機氮源組成，因此將這4部分分別作為影響因素，既考慮到了單個碳源和氮源的影響，又考慮到了這4個因素之間不同組合的影響，可使得到的優化培養基營養更為均衡，更有利于菌種的生長代謝。其次，在最優培養基組合基礎上依次進行培養基濃度、培養條件正交試驗，并進一步做了漆酶誘導試驗。

結果發現優化后亮菌漆酶酶活雖然有提高，但提高幅度很小，液體發酵所產漆酶的最高酶活只有7.92 U/mL，其原因可能是：①該菌本身在液體狀況下不具備良好的產漆酶的能力；②選擇的液體發酵培養基不適宜，尤其表現在碳氮源的組合上。菌株發酵碳氮源選擇具有強大的廣泛性，本試驗選擇的碳氮源只局限在其中的幾種，可能這幾種都不是亮菌具有良好液體發酵產漆酶能力的原料，因此還需要不斷嘗試；③碳氮比例不合適。雖然這幾種培養基菌體長勢不錯，但是菌體在生長階段和代謝產物產生時期所需的碳氮比往往不一樣，因此，這也是今后研究的重點；④漆酶有兩種，一種是可誘導型漆酶，一種是組成型漆酶。在擔子菌中，細胞外組成型漆酶的生產量是很低的。但是各種與木質素或木質素衍生物相關的芳香烴類和酚類化合物以及重金屬都可以顯著地提高漆酶的產量[5]，此試驗只選了愈創木酚、吐溫-80、苯酚、CuSO4作為誘導劑，具有很大的局限性，應加大誘導劑試驗范圍。

3.2 亮菌液體和固體發酵產漆酶能力的比較

以稻草、麥麩為主料優化亮菌固體發酵產漆酶培養條件后，亮菌漆酶酶活達3 496.7 U/g，以其為標準數值計算固體發酵每克干料產漆酶酶活和每克干料每天產漆酶酶活。結果表明，每天每克干料的產酶效率為492.89 U/g。以同樣的方式計算亮菌液體發酵每克干料的酶活和每克干料的產酶效率，結果表明，每天每克干料的產酶效率為15.6 U/g，固體發酵的產酶效率是液體發酵產酶效率的31.6倍。本實驗室曾以麥麩∶豆餅粉為8∶2進行培養，亮菌產漆酶酶活可達20 000 U/g左右，產酶效率更高[13]。綜合培養料的價格等因素，液體發酵成本較高。試驗結果表明固體發酵更適合亮菌產漆酶。

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