植物激素對靈菊七愈傷組織中黃酮含量的影響

范三微等

摘要：以靈菊七（Gynura medica）無菌試管苗葉片為外植體，接種于愈傷組織誘導培養基上，誘導形成愈傷組織，并進行愈傷組織繼代培養。將繼代培養的愈傷組織接種于含有不同激素（濃度）組合的愈傷增殖培養基上，以硝酸鋁顯色法測定其中黃酮的含量。結果表明，在4種愈傷組織增殖培養基上，愈傷組織中總黃酮含量最大值分別達到0.794%、2.112%、1.652%、2.792%。培養基MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L GA最適用于靈菊七愈傷組織中黃酮總量的積累。

關鍵詞：靈菊七（Gynura medica）；愈傷組織；植物激素；黃酮

中圖分類號：S567；Q943.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）06-1450-03

藥用植物靈菊七（Gynura medica）俗名仙草、長壽草，其在中國福建地區具有豐富資源，在浙江、江蘇、安徽等省區也有種植，民間采其植株莖、葉泡茶飲用來防治糖尿病已有較長的歷史。黃酮類化合物廣泛存在植物體內，具有多種生理功能，是多種中藥發揮生理作用的物質基礎[1-3]。國內學者對靈菊七的提取物生物活性研究證明靈菊七含有的黃酮類、酚類物質具有抗氧化活性[4]；靈菊七的水、醇提物對糖尿病大鼠有顯著治療作用[5，6]，這些研究顯示出靈菊七具有廣闊的降血糖藥用開發前景。

該研究以靈菊七葉片為外植體誘導形成愈傷組織，通過調整培養基中激素種類與濃度，促進愈傷組織合成黃酮類物質，為生物轉化法生產靈菊七黃酮提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

靈菊七植株采自安徽省六安市，經安徽師范大學周守標教授鑒定為Gynura medica Y. K. Yang et J.K.Wu，以此為母本開展組織培養研究，并獲得了大量的靈菊七試管苗，以此試管苗作為試驗材料[7]。

1.2 試驗儀器與試劑

MLS-3780型高壓蒸汽滅菌器購自日本Sanyo Industry公司；BCM-1000型生物凈化工作臺購自蘇州凈化設備有限公司；SPX智能型生化培養箱及PQX型多段智能人工氣候箱購自寧波江南儀器廠；R-205型旋轉蒸發儀購自上海申勝生物技術有限公司；SHB-Ⅲ型循環水式真空泵購自鄭州長城科工貿有限公司；HH-4型數顯恒溫水浴鍋購自常州國華電器有限公司；TU-1810型紫外可見分光光度計購自北京普析通用儀器有限公司。

鹽酸、亞硝酸鈉、乙醇、硝酸鋁等試驗試劑均為國產分析純；玉米素（ZT）、α-萘乙酸（NAA）、6-芐氨基嘌呤（6-BA）、激動素（KT）、赤霉素（GA）等植物激素及瓊脂均為國產生物試劑。

1.3 試驗方法

1.3.1 愈傷組織的誘導培養 以MS+2.0 mg/L ZT+0.5 mg/L NAA為愈傷組織誘導培養基，調節pH至6.0，常規滅菌。取無菌試管苗葉片，切成面積約1 cm2的小塊，每個培養皿接種10塊。置于人工氣候箱中（光照周期12 h，26 ℃，2 000 lx）進行愈傷組織的誘導培養，接種后每天觀察愈傷組織誘導情況。

1.3.2 愈傷組織中黃酮的增殖培養 將愈傷組織進行多次繼代培養，每次繼代培養周期為12 d。按2.0 g/瓶，把愈傷組織分別接種于不同激素組合的固體增殖培養基（表1）上（40 mL/100 mL三角瓶），通過檢測愈傷組織中黃酮含量考察不同激素對愈傷組織中黃酮生物合成的影響。置于人工氣候箱中（培養條件同誘導培養），接種后每2 d取樣一次，測定細胞增長量、總黃酮含量（均以干重計）。

1.3.3 蘆丁溶液標準曲線回歸方程的建立 精確配制0.1 mg/mL的蘆丁標準溶液，6個10 mL容量瓶中分別加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蘆丁標準溶液，再分別加入體積分數70%的乙醇5 mL、5% NaNO2溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min，加入質量分數10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min，然后加入1 mol/L NaOH溶液4 mL，再用蒸餾水定容，搖勻后放置15 min，于510 nm波長處測定其吸光度，繪制標準曲線。

1.3.4 愈傷組織中總黃酮的提取及含量測定 稱取適量愈傷組織，按料液比1∶30加入體積分數70%的乙醇溶液，50 ℃水浴回流2 h，過濾后將濾液旋轉蒸發濃縮至原體積的1/3，再用體積分數70%的乙醇溶液準確定容。按“1.3.3”中方法檢測愈傷組織中總黃酮的含量并進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 靈菊七愈傷組織的誘導

取靈菊七無菌試管苗葉片（圖1），接種在培養基MS+2.0 mg/L ZT+0.5 mg/L NAA上，進行愈傷組織的誘導。ZT顯示出了強烈的促進作用，在葉片組織塊接種后第9天，愈傷組織誘導率達到84.4%，第14天時達到100.0%，愈傷組織呈白色疏松狀（圖2）。

2.2 蘆丁溶液標準曲線回歸方程的建立

配制蘆丁標準溶液，按標準曲線測定的方法測定愈傷組織中總黃酮含量。以10 mL溶液中蘆丁標準品濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線[8，9]。計算蘆丁標準曲線回歸方程得：y=6.686 29x+0.004 17，相關系數r=0.999 5，說明在0～0.5 mg/10 mL范圍內線性關系良好。

2.3 不同植物激素對靈菊七愈傷組織中黃酮生物合成的影響結果

表1中設計了4種影響愈傷組織中黃酮生物合成的增殖培養基，其中1號與2號培養基的激素種類一致，但6-BA的濃度不一致；3號與4號培養基的激素種類不同，但各種激素的濃度一致。

按“1.3.2”中的方法計算細胞增長量。愈傷組織在不同激素組合的培養基上的生長情況見圖3。由圖3可知，愈傷組織快速生長期集中在接種后的10～26 d，隨后愈傷組織生長進入停滯期。比較愈傷組織在各培養基上的生長量，4組之間愈傷組織生長量雖有差異，但未達顯著性水平（P>0.05）。

在不同激素增殖培養基上培養時，靈菊七愈傷組織中總黃酮含量的變化情況見圖4。由圖4可知，靈菊七愈傷組織中黃酮大量積累的時間出現在接種后的18～36 d，第36天后愈傷組織中總黃酮的積累進入停滯期；黃酮積累量從高到低的培養基編號是4、2、3、1。

愈傷組織經過40 d的繼代培養，呈現出不同深淺的顏色，結果見圖5。從圖5可以看出，1號培養基上的愈傷組織主要呈白色，褐化不明顯（A）；2號培養基上的愈傷組織呈淺綠色，無褐化（B）；3號培養基上的愈傷組織主要呈黃綠色，褐化比較明顯（C）；4號培養基上的愈傷組織為較深的綠色，少部分褐化（D）。

雖然愈傷組織的生長量各培養基間無顯著性差異，但其中黃酮的含量則有差異，結果見表2。由表2可知，呈白色的愈傷組織黃酮含量為0.794%，而呈綠色的愈傷組織中黃酮含量達2.792%，1號培養基的愈傷組織黃酮含量極顯著低于2、3、4號培養基上的愈傷組織（P<0.01），3號培養基的愈傷組織黃酮含量也低于2、4號培養基的。

3 小結與討論

本研究以靈菊七葉片為外植體誘導形成愈傷組織，并接種于4種不同的增殖培養基上，以獲得黃酮為目的進行培養。本課題組對靈菊七愈傷懸浮培養的研究發現，在細胞對數生長期時細胞內有大量糖類物質的積累[10]，而黃酮含量非常低。細胞對數生長期時愈傷組織中黃酮的積累也處于較低的水平，而細胞干重持續增加，可能是由于細胞糖類、蛋白類物質積累產生的結果。靈菊七愈傷組織中黃酮大量合成是在細胞進入對數生長期以后，當細胞生長處于停滯期時愈傷組織中黃酮的生物合成非常旺盛，并達到最大積累量。黃酮是植物的次生代謝產物之一，其生物合成的起始底物為香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A[11]。植物細胞內乙酰輔酶A來源于糖類代謝，因此愈傷組織中干物質的積累有利于黃酮的生物合成。

本研究中愈傷組織增殖培養前所有的愈傷組織均培養在培養基MS+2.0 mg/L ZT+0.5 mg/L NAA上，因此接種于不同增殖培養基上的愈傷組織中黃酮含量無差異，而經過40 d的繼代培養，愈傷組織中黃酮類的積累量之間呈現出差異（表2）。1、2號培養基中激素種類相同，組激素濃度不同。當6-BA∶NAA=1時，愈傷組織中黃酮最大積累量為0.794%；當6-BA∶NAA=4時，愈傷組織中黃酮最大積累量（2.112%），表明6-BA濃度高于NAA濃度時有利于愈傷組織中黃酮類的生物合成。3、4號培養基中激素種類不同，各激素濃度相同，3號培養基上愈傷組織中黃酮最大積累明顯低于4號培養基上的愈傷組織，表明GA促進黃酮生物合成的作用比KT強。綜上分析表明，靈菊七細胞內黃酮生物合成受激素濃度和激素種類的影響。有研究報道菊三七屬植物紅鳳菜（Gynura bicolor）花色素的生物合成受茉莉酮酸酯誘導而在根中合成，進一步研究發現處理紅鳳菜的組培苗根，茉莉酮酸酯誘導了調控類黃酮生物合成基因GbMYB1、GbMYC1的協同表達，造成花色素在根中的積累[12，13]。花色素和黃酮都是類黃酮化物之一，生物合成花色素的前體也是黃酮生物合成的前體。靈菊七與紅鳳菜都是菊三七屬植物，并且都能合成紫色的色素，因此推測與黃酮類生物合成有相似的機理。究竟是何種激素對靈菊七黃酮生物合成發揮調控作用，有待于進一步的研究。

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