HPLC法測定羌活中紫花前胡苷的含量

黃育生　袁賢琳　鐘瑜　王汝俊

【摘要】目的：建立HPLC法測定羌活中紫花前胡苷含量的方法。方法：HPLC條件：色譜柱為Agilent Hc-C18柱（5μm，4.6×250mm），流動相為甲醇-水（32：68），流速為1.0ml·min^-1，檢測波長為335nm，柱溫為35℃。結果紫花前胡苷范圍為4.00μml^-1-100μm·ml^-1，平均回收率為99.90%，RSD為1.50%。結論：該法操作簡單，重現性好，結果準確，可作為羌活中紫花前胡苷的含量測定方法提供參考依據。

【中圖分類號】R284.1 【文獻標識碼】A 【文章編號】1007-8517（2013）10-0014-02

羌活為傘形科植物羌活Notopterygium incisum Tinz exH.T.Chang或寬葉羌活Notopterygium franchetii H.deBoiss，的干燥根莖和根。本品具有解表散寒，祛風除濕，止痛的功效，常用于治療風寒感冒，頭痛項強，風濕痹痛，肩背酸痛。其主要成分有香豆素類成分（如紫花前胡苷、羌活醇及異歐前胡素等）、揮發油、阿魏酸等。有研究表明紫花前胡苷是羌活的有效成分，具有鎮痛、抗炎作用。但是2010年版藥典第一部只收載了羌活醇和異歐前胡素總量的含量測定方法，且目前對于HPLC法測定羌活中的紫花前胡苷含量的報道很少。本文研究建立了HPLC法測定羌活中的紫花前胡苷含量，為羌活的質量控制及復方制劑中羌活的有效成分轉移率提供新的參考依據。結果表明本方法操作簡單，準確，重現性好。

1、儀器與試藥

高效液相色譜儀：SPD-20A紫外檢測器，LC-20AT泵（日本島津公司）；Saxtorious BT 25S電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；HH-6數顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）；KQ-100DE型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

羌活中藥飲片（批號20100702，佛山市中藥飲片廠有限公司）；紫花前胡苷對照品（批號111821-201102，中國食品藥品檢定研究所）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。2色譜條件與系統適用性

Agilent HC-C18色譜柱（5μm，4.6×250mm）；流動相：甲醇一水（32：68）；流速：Iml·min^-1；柱溫：35%；檢測波長：335nm。紫花前胡苷峰與前后峰的分離度均在1.5以上，理論板數按紫花前胡苷峰計算應不低于3000。

3、實驗方法與結果

3.1 對照品溶液的制備 精密稱取紫花前胡苷對照品，加甲醇制成每lml含40μg的溶液，即得。

3.2 供試品溶液的制備 取藥材粉末（過三號篩）約0.5g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，稱定重量，超聲30min。放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液25ml，置于蒸發皿中，水浴蒸干，殘渣用水約20ml使溶解，并轉移至分液漏斗中，用水飽和正丁醇萃取4次，每次20ml，合并正丁醇液，水浴蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉移至25ml量瓶中，稀釋定容至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。3.3測定法分別精密吸取對照品溶液51xl和供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，見圖1。3.4線性關系考察精密稱取紫花前胡苷對照品5.00mg置于25ml的量瓶，用甲醇稀釋至刻度，即得濃度為O.20rag·ml^-1的對照品溶液貯備液，分別精密量取上述貯備液0.2、0.5、1、2、3、4、5ml，置于10ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得濃度為4.00、10.00、20.00、40.00、60.00、80.00、100.00μg·ml^-1的梯度對照品溶液，精密量取上述梯度對照品溶液各5μl，按上述色譜條件測定，以對照品峰面積Y為縱坐標，對照品溶液（μg/ml）為橫坐標，繪制標準曲線。結果表明：紫花前胡苷濃度在4.00μg·ml^-1～100.00μg·ml^-1范圍內與峰面積具有良好的線性關系，回歸方程為：Y=270.85+1.3598×104X.r=0.9999。

3.5 精密度試驗精密吸取同一對照品溶液5μl連續進樣6次，記錄峰面積，計算紫花前胡素峰面積的RSD（n=6）為0.4%，表明儀器精密度良好。

3.6 重復性試驗 取同一批藥材，按供試品溶液制備方法平行制備6組供試品溶液，按上述色譜條件測定，結果樣品中紫花前胡苷的平均含量（n=6）為0.266%，RSD為2.9%。3.7穩定性考察取同一個供試品溶液，分別于O、2、4、6、8、10、12h進樣，按上述色譜條件測定，結果紫花前胡苷峰面積的RSD（n：7）為O.3%，表明供試品溶液在12小時內穩定。

3.8 加樣回收率試驗 精密稱取“3.6”項下已知紫花前胡苷含量的羌活藥材粉末（過三號篩）約O.25g，分取6份，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入濃度為O.0133mg·ml^-1的對照液50ml（精密稱取紫花前胡苷對照品6.65mg，置于500ml量瓶，用50%甲醇稀釋至刻度，即得濃度為0.0133rag·ml^-1的對照液），稱定重量，超聲30min。放冷，再稱定重量，用濃度為0.0133mg/ml的對照液補足減失的重量，搖勻，濾過，按“3.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算回收率，結果平均回收率（n=6）為99.64%，RSD為1.22%。見表1。

3.9 樣品測定 取產地為四川的羌活藥材，共5批，按“3.2”項下的方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，結果見表2。

4、討論

4.1 樣品萃取純化試驗中發現，只對羌活進行超聲處理，供試品中雜質較多，而用水飽和正丁醇萃取之后與前者比較，雜質大大減少，并且紫花前胡苷的含量無明顯差異，故從保護色譜系統，減少雜質干擾方面考慮，選擇用水飽和正丁醇處理純化供試品溶液。試驗比較結果亦表明萃取四次后，第五次的萃取液幾乎不含紫花前胡苷。

4.2 樣品提取方法的選擇試驗中對加熱回流提取1h和超聲處理30min的樣品中的紫花前胡苷提取效果進行對比，結果表明兩種方法對紫花前胡苷的提取效果無明顯差異，但超聲處理方法簡便快捷，故選擇超聲處理30min。

4.3 提取溶劑的選擇 試驗中對比了甲醇和50%甲醇對紫花前胡苷提取效果的影響，結果表明，兩者對紫花前胡苷的提取效果無明顯差異，故從成本及環保等方面考慮，選擇50%甲醇為提取溶劑。

4.4 超聲時間的選擇 試驗中對比了20、30、40min三個超聲時間對紫花前胡苷提取效果的影響，結果表明30min和40min的提取效果無明顯差異，而比20min的提取效果略高，故選擇超聲處理30min。

4.5 吸收波長與流動相比例選擇 取紫花前胡苷對照品的甲醇溶液，在紫外分光光度計190～400nm波長掃描。結果在335nm波長處有最大吸收，故選擇335nm為本品的測定波長，見圖2。

流動相甲醇一水的比例調節為32：68時，紫花前胡苷峰與前后峰的分離度均大于1.5。

4.6 孫玉茹等的研究，流動相為甲醇-水-乙腈（6：71：21）測定羌活中紫花前胡苷含量，紫花前胡苷的保留時間較小，試驗中發現，供試品雜質較多，較小保留時間可能會有峰的重疊，分離度不符合要求。朱美曉等的研究，以乙腈-水（15：85）為流動相，使用不同色譜柱Phenome-nex Synergi 4μ Hydro-RP C18，Phenomenex Luna C18和Agi-lent Extend-C18測定羌活中紫花前胡苷含量，只有Phe—nomenex Synergi 4μ Hydro-RP C18能達到最佳分離效果，而其他色譜柱都不能有效分離。而本試驗使用Agilent HC-C18色譜柱（5μm，4.6×250mm），以甲醇-水（32：68）亦能達到有效分離。

某些中藥亦含有紫花前胡苷，如紫花前胡、前胡等，并有HPLC法紫花前胡苷含量測定的相關標準文獻報道。

本試驗參考上述相關標準及文獻的方法，考察各個因素對紫花前胡苷提取效果及HPLC色譜分離效果的影響，最終優化建立了HPLC法測定羌活中紫花前胡苷含量的方法，該法操作簡單，重現性好，結果準確，可作為羌活中紫花前胡苷的含量測定方法提供參考依據。尤其是中藥復方制劑成分復雜，使用水飽和正丁醇萃取可有效地純化紫花前胡苷，減少雜質，這對含羌活的復方制劑的質量控制有重大的參考意義。