維生素C和維生素E聯合應用對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用

彭燕　程也　張斯文

【摘要】目的：觀察維生素c（Vitc）和維生素E（VitE）以及VitC和VitE聯合應用對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用。方法：采用夾閉腎蒂1h進行并再通進行缺血再灌注損傷的造模，再灌注前10min在不同分組的大鼠進行舌下靜脈注入Vit（200mg/kg）；VitE乳劑（100mg/kg）以及vit（200mg/kg）和VitC聯合使用。再灌注2h后測定腎組織勻漿MDA含量及SOD活性，血肌酐，尿素等指標從而觀察缺血再關注損傷程度及藥物保護作用。結果：VitC給藥組、VitE給藥組以及VitC、E聯合給藥組的腎組織勻漿SOD活性明顯高于模型組。其中以VitC、E聯合給藥組最為顯著（p<0.01）；MDA，血肌酐，血尿素值均低于模型組（p<0.05），以VitC、E聯合給藥組改善最為顯著（p<0.01）。VitC、E聯合給藥組與VitE給藥組和VitC給藥組相比也有顯著差異（p<0.05）。結論：VitC和VitE對腎缺血再灌注損傷具有協同保護作用。

【關鍵詞】維生素C；維生素E；缺血再灌注損傷

【中圖分類號】R151.2 【文獻標識碼】A 【文章編號】1007-8517（2013）10-0023-03

腎缺血再灌注損傷（Ischemia/Reperfusion Injury，/RI）是臨床上常見的病理生理現象，腎臟的移植是產生腎臟缺血再灌注損傷的主要情形。其中自由基損傷和脂質過氧化是缺血再灌注損傷的主要機制。對于。腎臟缺血再灌注損傷的保護藥物近年來也在不斷的研究與開發之中，Nakaga-wa和Cicalese證實了利用超氧化物歧化酶（sOD）和還原性谷胱甘肽的抗自由基及脂質過氧化作用。但是由于SOD的來源受限以及價格比較昂貴，谷胱甘肽的作用發生需要阿爾法硫辛酸的存在下放能發揮作用。

因此我們可以考慮同樣具有抗氧化作用且方便而且價格便宜對人體副作用比較小的維生素c和維生素E作為缺血再灌注損傷的保護藥。

研究顯示，再灌注前經脈注射VitC和（或）VitE乳劑可有效保護大鼠肺的缺血再灌注損傷，表現在組織損傷程度降低，肌酐尿素氮升高水平得到控制。但是VitC和VitE對腎臟缺血再灌注損傷的保護效果以及聯合運用效果和與其它陽性藥物效果的比較目前缺少報道。因此我們用大鼠復制了腎缺血再灌注模型，進行VitC和VitE乳劑以及聯合用藥對缺血再灌注保護作用的研究，通過檢測血肌酐、尿素氮、SOD和MDA等指標對動物缺血再灌注損傷程度進行檢測。

1、材料和方法

1.1 實驗動物及分組 雄性SD大鼠120只（健康狀況良好），體重232±10.8g，購自吉林大學實驗動物中心。平均分為6組，每組20只。1組為假手術組（開腹不接扎腎蒂），給予生理鹽水注射0.5ml；2-6組進行缺血再灌注造模處理（結扎腎動脈60min）：其中2組每只給谷胱甘肽2mg/kg，加生理鹽水至0.5ml；3組每只給維生素c 200mg/kg，加生理鹽水至0.5ml；4組每只給維生素E 100mg/kg，加生理鹽水至0.5ml；5組為維生素c、E聯合給藥，每只給維生素c 200mg/kg、維生素E 100mg/kg，加生理鹽水至0.5ml；6組為模型組，給予生理鹽水每只0.5ml。

1.2 主要藥品與試劑 VitC；購自長春亞泰藥業集團（批號：20090803）；VitE；購自長春亞泰藥業集團（批號：20090815）；還原性谷胱甘肽：購自重慶藥友制藥有限責任公司（批號：20100321）；MDA試劑盒：購自長春生物制品所（批號：20090923）；尿素氮試劑盒：購自長春生物制品所（批號：20090925）；肌酐（cr）試劑盒：購自長春生物制品所（批號：20090809）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒：購自長春生物制品所（批號：20090703）。

1.3 復制缺血再灌注損傷模型 3%的戊巴比妥鈉腹腔內注射麻醉，將大鼠仰臥固定于手術臺上。腹腔注射20%烏拉坦0.5ml/100g，麻醉徹底后，大鼠按仰臥位固定，經腹腔入路。從大鼠腹側正中劍突下方向下開一約5em的口，將腸管翻至體外，找到兩側腎臟后，用結扎線結扎腎蒂，結扎線系活結，結扎完畢后將腸管還納，用止血鉗將切口鉗住。皮下注射少量生理鹽水。結扎時間為60min，再灌注前10min進行舌下靜脈給藥。手術結束后，切口周圍用青霉素消毒，之后進行縫合。給藥2小時后，準備進行相關指標的檢測。之后打開腹腔。分離暴露腹主動脈，用注射器直接穿刺動脈采血5ml用于血漿中MDA，肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）的檢測。之后繼續抽血，處死動物。同時分離左腎，取腎上極組織0.5g，用4.5ml生理鹽水在4℃下用電動勻漿機以12000r/min研磨制成10%腎組織勻漿。

1.4 指標測定 嚴格按照試劑盒說明書操作，測定腎組織MDA含量，SOD含量，血肌酐含量，學尿素氮含量，腎組織形態學觀察，取腎下極組織，置于4%甲醛中固定，常規石蠟包埋，切片，HE染色觀察。

1.5 統計學處理 采用SPSS15.O軟件進行統計學處理，實驗所得數據用（x±s）表示，組間進行t檢驗，計數資料比較用X²檢驗。

2、結果

2.1 MDA的測量值 MDA吸光度的測量結果見表1，計算后的MDA值見表2。

經計算后的MDA值在假手術組最低，并且在模型組最高。統計學檢測T檢驗表明：經維生素C和維生素E處理后的動物的MDA值低于模型組（六組）P<0.05；經維生素C和維生素E處理后MDA值低于維生素C組和維生素E組，P

2.2 血肌酐的測量值 血肌酐測量值見表3，經計算后的MDA值在假手術組最低，并且在模型組最高。統計學檢測T檢驗表明：經維生素C和維生素E處理后的動物的MDA值低于模型組（六組）P<0.05；經維生素C和維生素E處理后MDA值低于維生素C組和維生素E組，P<0.05。

2.3 血尿素的測量值 血尿素的測量值見表4：計算后的MDA值在假手術組最低，并且在模型組最高。統計學檢測T檢驗表明：經維生素C和維生素E處理后的動物的MDA值低于模型組（六組）P<0.05。

2.4 各組大鼠腎組織HE染色病理改變 光鏡下可見假手術組腎小球、腎小管結構完整，腎間質未見明顯異常。模型組大量腎小管上皮細胞腫脹、壞死，部分腎小管管腔擴張，腔內可見蛋白性液體、紅細胞或細胞碎片，腎間質高度充血、炎細胞浸潤明顯。

其余3個治療組腎組織病變與缺血再灌注組比較均有所減輕，僅見少部分腎小管管腔擴張，偶見管型，腎間質炎細胞浸潤不明顯。上述各組均未見腎小球明顯病理改變。

3、討論

由于缺血再灌注損傷主要機制為自由基損傷和脂質過氧化等等。因此，缺血再灌注損傷的治療和實驗研究方面多圍繞這兩個方面展開。SOD活力的高低間接反映機體清除自由基的能力，而MDA的量常?？煞从硻C體內脂質過氧化的程度，間接地反映出細胞損傷的程度。血肌酐和尿素氮是反應腎損傷的敏感指標，可間接反應腎臟受缺血再灌注損傷的程度。

3.1 維生素c及維生素E對缺血再灌注損傷的保護作用實驗結果表明：在給予維生素C和維生素E的處理后，SOD，MDA，肌酐和血尿素的數值有了顯著的改善，表明它們具有顯著的抗氧化作用。結果與梁應平和蔡虹靜等研究結果基本一致。

由于維生素C具有重要的抗氧化性，它還能防止脂質過氧化，促進維生素E循環再生，清除體內自由基和活性氧物質，防止癌癥的發生和惡化。維生素c的多項生理功能都與其抗氧化性有關。作為一種天然的水溶性抗氧化劑，它能直接清除生理代謝過程中產生的過量自由基，使機體免受損害。維生素E是O^-₂的直接清除劑，與超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物一起構成體內抗氧化系統，保護細胞膜及細胞內的核酸免受自由基的攻擊。報道維生素E能保護LDL免遭氧化損傷，可有效拮抗氧化型低密度脂蛋白刺激Ca²⁺攝入的作用，而LDL可能正是血管氧化損傷的主要成分。

3.2 維生素C與維生素E聯合應用對缺血再灌注損傷的保護作用 通過MDA值的計算（表2），在VitCE聯合用藥處理組（5組）的MDA值顯著低于模型組（6組）；并且5組與3組和4組也有顯著的差異（P<0.05），表明維生素CE聯合應用后對缺血再灌注損傷的保護作用要明顯好于直接應用維生素C或維生素E。

同時血尿素和血肌酐的測定結果表明（表3，表4）：VitC和VitE聯合應用后與維生素C或維生素E單獨使用相比具有更好的缺血再灌注損傷的保護作用。

其中VitE單獨使用對腎臟缺血再灌注損傷的保護作用較低（SOD值較低，MDA，肌酐，尿素氮值較高），這可能與VitE-自由基還原成VitE，有助于/VitE的再生O，從而發揮協同抗氧化功能。

而維生素CE聯合應用的協同抗缺血再關注的機制尚不清晰。可能與以下機制有關：

第一：維生素C和維生素E都是抗氧化劑，均具有抗自由基損傷和紙質過氧化的功能，起協同作用。同時由于VitC為水溶性，VitE為脂溶性，他們的聯合應用產生協同效果；第二：由于維生素E的存在也能防止維生素C的氧化，保證在體內的生理功能，如維生素E能直接接受自由基的氧化，從而預防和消除Fe²⁺和Cu²⁺所引起的維生素c的不良反應。同時，VC具有重要的抗氧化性，當VitE（生育酚）與自由基起反應后，即轉變為生育酚羥基自由基，此化合物可被維生素c重新還原為生育酚，重新發揮其抗氧化作用；第三：預先給予VitC對組織中脂質過氧化物（LPO）的生成有一定的抑制作用，且VitC和VitE聯合應用的抑制效果更好，同時也增加超氧化物歧化酶活性。

4、討論

目前關于缺血再灌注損傷的保護藥主要以超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽、亞硝酸納等藥物為主。但是它們在使用上都有一定的局限性，SOD的價格以及還原型谷胱甘肽的易氧化性使得它們的臨床應用還具有一定的弊端。亞硝酸鈉通過NO對缺血再灌注起到保護作用同樣面臨易被氧化，此外，亞硝酸鹽類物質的毒性不可忽略。VitC和VitE的聯合使用使它們的治療效果大大提升，以至基本接近亞硝酸鈉的水平，并且它們的來源方便，對人體沒有危害較小，同時，VitC和VitE具有的美自和滋潤肌膚等功效也會使它們的功能復合化和多元化，因此會在臨床上預防和治療缺血再灌注損傷有著很好的應用前景。但是，考慮到VitC和VitE的溶解性存在一定的差異，在復方制藥上會有一定的難度，同時，VitC和VitE的相互作用機制還需要深層次的探討以及聯合用藥缺少臨床的實際觀察，因此，VitC和VitE聯合應用于缺血再灌注損傷還需要進一步的研究與驗證。