H₂O₂對Pb脅迫下小麥幼苗抗氧化酶及細胞活性的影響

葉亞新，陸丹華

摘要：以小麥（Triticum aestivum L.）為試驗材料，采用完全營養液進行培養，外加適當濃度的過氧化氫（H2O2），同時以不加H2O2為對照，再以不同濃度Pb溶液培養進行Pb脅迫，檢測小麥幼苗過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）的活性及丙二醛（MDA）含量、根系活力及微核率等指標的變化，以探究外源H2O2對Pb脅迫下小麥抗氧化酶及其細胞活性的影響。結果表明，Pb脅迫下小麥幼苗的生長代謝受到一定程度的抑制，主要表現為根系活力下降，POD、SOD、CAT活性增強，MDA含量和微核率上升；經適當濃度H2O2處理后，Pb脅迫小麥幼苗中POD、SOD、CAT活性及根系活力與對照相比有不同程度地上升，MDA含量及微核率下降，這表明外加H2O2對Pb脅迫小麥所受的傷害有一定的緩解作用，可增強小麥幼苗對重金屬Pb的抗性。

關鍵詞：小麥（Triticum aestivum L.）；H2O2；Pb脅迫；抗氧化酶；根系活力；微核率

中圖分類號：Q945.78；S512.1 文獻標識碼： A 文章編號：0439-8114（2013）05-1007-05

Effect of Hydrogen Peroxide on Antioxidant Enzymes and Cell Activity of Wheat Seedlings under Lead Stress

YE Ya-xin，LU Dan-hua

（School of Chemistry and Bioengineering， Suzhou Science & Technology College， Suzhou 215009，Jiangsu， China）

Abstract： To explore the effect of exogenous H2O2 on antioxidant enzymes and other physiological indexes of wheat seedlings under lead stress， wheat seedlings cultivated in solution with different concentration of H2O2 were used to observe the variation of activity of peroxidase （POD）， superoxide dismutase （SOD）， catalase （CAT） and content of malondialdehyde （MDA）， root activity and micronucleus rate. The results showed that wheat seedlings were chronically harmed under heavy metal stress， as vigor of wheat seedling root decreased； POD， SOD， CAT activity and MDA content， micronucleus rate increased. After being treated by H2O2 with appropriate concentration， POD， SOD， CAT activity， root vigor increased while MDA content and micronucleus rate decreased in wheat seedlings under lead stress compared to control， indicating that exogenous H2O2 could reduce the damage caused by lead stress.

Key words： wheat（Triticum aestivum L.）； H2O2； lead stress； antioxidant enzymes； root activity； micronucleus rate

目前，在令人擔憂的環境問題中，Cd、Pb等重金屬污染因對植被造成強烈沖擊以及沿食物鏈的富集作用而倍受關注。Pb作為一種有毒的重金屬元素進入土壤后不能被微生物降解，一旦污染土壤，很難去除。有關植物受到重金屬脅迫后自身抗氧化酶活性的變化已有一些研究，但主要集中在對Hg、Cd等重金屬的研究上。關于植物受到Pb脅迫后對自身抗氧化酶活性及細胞活性的影響還少見報道。植物的生長發育受激素和環境信號的調控。過氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2）是一類重要的信號分子，在生物體內積累過多時會對生物體產生毒害作用[1]；但另一方面， 稀H2O2（<10 mg/L）能夠提高水稻幼苗抗氧化酶活性，降低丙二醛（MDA）含量[2]；H2O2還與其他信號特別是植物激素相互作用，影響一些蛋白激酶與蛋白磷酸酶等一系列下游信號分子的產生和參與[3]。因此，H2O2可能在植物應對環境脅迫反應中發揮著重要的作用。

為探究H2O2對Pb脅迫下小麥（Triticum aestivum L.）幼苗抗氧化酶活性及細胞活性的影響，以小麥種子為培育對象，模擬Pb污染，外加H2O2培育后測定抗氧化酶活性及其他細胞活性指標，旨在考察利用H2O2作為植物抗重金屬脅迫的拮抗劑的可能性，為H2O2在農業上的潛在應用提供生理生化依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試小麥品種為永良4號，由蘇州市種子公司提供。

1.2 試驗設計

1.2.1 小麥幼苗培育方法 小麥種子用水沖洗多次，挑除雜質，除去漂浮的種子，用10% H2O2浸泡 10 min，然后用去離子水沖洗4～5次，直至沖洗干凈。淘洗后放入多于種子體積2～3倍的清水中，在室溫下浸種8 h。

浸種后將挑選種子均勻放入底部鋪有濕濾紙的培養皿中，在培養皿中放少量的去離子水（半浸沒種子為宜），蓋好培養皿，置于25 ℃的培養箱中催芽。水培催芽3 d左右，等根長至2 cm左右時撤掉下方的濾紙，以防小麥根長在濾紙上，然后去除小麥胚乳，分裝到洗凈晾干的培養皿中，繼續置于25 ℃的培養箱中加完全培養液進行培養。待幼苗長出第二片真葉（二葉期，完全培養液培養4～5 d后）時進行H2O2對Pb脅迫下小麥幼苗影響的系列處理試驗。

1.2.2 H2O2濃度的選擇 為了確定H2O2對小麥幼苗生理功能的最佳效應濃度，設置了0.000 0（CK）、100.000 0、1.000 0、0.010 0、0.000 1 mmol/L 5種濃度的H2O2梯度溶液，加入小麥幼苗的完全培養液中，對照組加入等量蒸餾水，恒溫培養5 d后測定小麥幼苗葉片的質膜透性，探究H2O2的劑量效應并進行H2O2最佳效應劑量篩選。

1.2.3 小麥幼苗處理方法 挑選相同長勢的小麥幼苗分為兩組，將試驗組小麥的完全培養液中加入適量上述試驗所選取最適濃度的H2O2進行預處理，CK組的完全培養液中加入等量去離子水，放入恒溫培養箱中繼續培養。培養72 h后將試驗組和對照組均分為4小組，分別添加到0、10、50和100 mg/L的Pb（NO3）2溶液中，加入完全培養液后置于30 ℃、光照強度33%、光照14 h、黑暗10 h的光照培養箱中培育小麥，試驗期間保證幼苗水培營養液充足，每天2次添加培養液，必要時更換完全培養液。5 d后分別測定兩組小麥幼苗的過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）的活性及MDA含量、根系活性和根尖細胞微核率。

1.3 測定方法

POD、SOD、CAT活性及MDA含量、根系活力、葉片質膜透性（以相對電導度反映）的測定參照文獻[4，5]；根尖細胞微核率的測定參照文獻[6]。所有試驗數據均采用統計軟件SPSS 11.0進行相應分析處理。

2 結果與分析

2.1 H2O2溶液最適濃度的選擇

梅俊學[7]、肖雯等[8]研究表明質膜的通透性可反映質膜系統的完整性及其傷害程度，質膜透性越大，植物受傷害程度也就越大。由圖1可知，在不同濃度H2O2處理的小麥幼苗中，以0.010 0 mmol/L H2O2作用效果最好，不同濃度H2O2對小麥幼苗葉片質膜透性的效應由大到小依次為100.000 0、1.000 0、0.000 1、0.010 0 mmol/L。結果表明，高濃度的H2O2對小麥幼苗葉片有較嚴重的傷害作用，說明其在生物體內積累過多時，會對生物體產生毒害作用。而低濃度的H2O2處理時小麥幼苗葉片質膜透性較小，即低濃度的H2O2溶液在一定程度上能增加小麥膜結構的穩定性，增強小麥幼苗抵抗逆境的能力。因此，后續H2O2對Pb脅迫小麥幼苗的影響試驗均采用最佳作用效應濃度0.010 0 mmol/L。

2.2 H2O2對Pb脅迫下小麥幼苗葉片POD活性的影響

POD對各種不良環境十分敏感，可作為判斷傷害程度和植物抗性大小的指標[9]。試驗結果（圖2）顯示，當小麥幼苗遭受到Pb2+脅迫時，POD活性發生相應變化。隨著Pb（NO3）2脅迫濃度的升高，小麥幼苗POD活性逐漸升高，表明在一定濃度重金屬脅迫下，植物體內 POD受到活性氧自由基的誘導，活性上升，參與清除自由基，在這一層面上講POD活性的增加既表明了植物已經受到了重金屬Pb的脅迫，同時也是一種保護機制。從圖2可以看出，經過H2O2預處理后的小麥幼苗POD活性比對照有了一定程度的上升。說明H2O2能夠在一定程度上增強小麥葉片的POD活性。

2.3 H2O2對Pb脅迫下小麥幼苗葉片SOD活性的影響

SOD作為氧自由基的清除劑，其活性高低與植物抗性密切相關[10，11]。黃玉山等[12]認為SOD活性提高是相應于活性氧增加的一種急性解毒措施，使細胞免受毒害的調節反應。由圖3可見，經過H2O2預處理后的小麥幼苗葉片SOD活性與對照相比均有小幅上升，但在高濃度Pb（NO3）2溶液脅迫下，二者SOD活性均明顯下降。說明各個劑量的Pb（NO3）2溶液對小麥幼苗已經造成傷害時，H2O2有利于小麥抵抗Pb脅迫所誘導的氧自由基對自身的傷害。但是當脅迫程度過于嚴重時，植物的自身調節系統被破壞，SOD活性下降。本試驗結果與前人的研究結果一致[13]。這說明以SOD為代表的抗氧化酶系統對Pb毒害的保護作用是有限度的。當植物處于相對較低濃度的重金屬脅迫時，植物體內產生較多氧自由基作為一種機體應激自衛反應，SOD活性上升可以提高植物清除氧自由基的能力，從而在一定程度上緩解氧自由基積累對細胞的破壞。但是，隨著重金屬脅迫濃度的增加至超過植物所能耐受的極限時，植物的自身調節系統被破壞，作為防御體系的酶的活性也相應減弱。這與低濃度重金屬脅迫促進酶活性、高濃度重金屬脅迫抑制酶活性的理論相符。

2.4 H2O2對鉛脅迫下小麥幼苗葉片CAT活性的影響

當外界環境對植物產生脅迫時，CAT作為清除H2O2的主要酶類，其活性會產生變化[14]。試驗結果（圖4）顯示，隨著Pb（NO3）2濃度的升高，小麥幼苗葉片的CAT活性逐漸升高。經過H2O2預處理后的小麥幼苗葉片中CAT活性均明顯升高，且在低濃度Pb（NO3）2溶液脅迫時CAT活性上升幅度較高。

2.5 H2O2對Pb脅迫下小麥幼苗葉片中MDA含量的影響

MDA作為膜脂過氧化指標，用于表示細胞膜脂過氧化程度和植物對逆境條件反應的強弱[15]，其積累還可能對植物膜和細胞造成一定的傷害[16]。試驗結果（圖5）顯示，在Pb（NO3）2溶液處理下，小麥幼苗MDA含量明顯升高，且隨著Pb（NO3）2濃度的增大，MDA含量升高，即高濃度的重金屬對幼苗的脅迫作用更強。這表明植物處于逆境時，體內產生并積累的大量活性氧會引發膜脂過氧化，產生MDA等有害的膜脂過氧化產物。經過H2O2預處理的小麥葉片其MDA含量均比相應濃度對照組低，且低濃度Pb（NO3）2溶液處理的小麥MDA含量下降較明顯，表明適當濃度的H2O2在一定程度上能降低植物體內MDA含量，減緩Pb2+對小麥幼苗的傷害；但當作用于小麥幼苗的Pb（NO3）2濃度較大時，H2O2表現出對重金屬脅迫下小麥幼苗的防護效應減弱。

2.6 H2O2對Pb脅迫下小麥幼苗細胞活性的影響

2.6.1 H2O2對Pb脅迫下小麥幼苗根系活力的影響 根系活力是一種較客觀地反映根系生命活動的生理指標[17]。植物遭受逆境脅迫時，植物體內琥珀酸脫氫酶減少，根系活力下降。由圖6可以看出，小麥幼苗在Pb（NO3）2溶液脅迫下根系活力逐漸下降，其處理濃度越高，幼苗根系受到的傷害越大，根系活力越低。經H2O2溶液預處理后的小麥幼苗根系活力有一定提高，但是在高濃度Pb（NO3）2溶液脅迫下根系活力提高較少。這說明H2O2可以一定程度地緩解Pb脅迫對小麥幼苗根系造成的傷害。但H2O2對其的緩解能力在高濃度Pb環境下作用較小。

2.6.2 H2O2對Pb脅迫下小麥幼苗根尖細胞微核率的影響 細胞分裂中染色單體或染色體的無著絲粒斷片或滯后染色體不包被于主核中，獨立存在于細胞質中，類似細胞核，但體積較小，稱為微核[18]。其形成機理一般認為是生物在環境中受到輻射或其他誘變因子作用時，細胞間期細胞受到損傷而產生微核。植物幼苗的根尖對環境污染物比較敏感，可以利用其微核效應監測環境污染物對植物的遺傳毒理效應。由圖7可以看出，小麥幼苗在Pb（NO3）2脅迫下，根尖細胞微核率逐漸上升。Pb（NO3）2的處理濃度越高，微核率越高，幼苗根系受到的傷害越大。經H2O2溶液預處理后的小麥幼苗根尖細胞微核率均有所下降，說明H2O2對Pb脅迫下小麥幼苗根系的遺傳毒性有一定的防護作用。

3 討論

逆境脅迫導致植物體內活性氧自由基的產生和清除失衡，造成植物體內自由基累積，導致膜脂過氧化，對植物的生長產生傷害。H2O2是一種重要的信號分子，能介導植物對非生物脅迫的適應反應。本研究表明，當用適當濃度的H2O2預處理小麥幼苗時，植物抗氧化酶POD、SOD、CAT活性增加，延緩膜脂過氧化作用的發生，從而降低了Pb脅迫小麥幼苗葉片中的MDA含量，提高了膜的穩定性，增強了小麥幼苗抵抗Pb脅迫的作用。

H2O2是活性氧重要的代表之一，激素等信號或者生物、非生物脅迫刺激均可誘導植物細胞內H2O2的產生和積累。H2O2化學性質比較穩定，壽命較長，具有較高的跨膜通透性并能在植物細胞間迅速擴散，外界刺激能迅速地刺激其合成和分解，這些特點均符合細胞間信號分子所具有的重要標準。越來越多的證據表明，H2O2在植物面臨環境脅迫反應中發揮著重要作用，比如應對逆境產生抗病防御反應、調控植物的生長發育、參與保衛細胞氣孔運動等諸多生理過程。H2O2還與其他信號分子特別是植物激素相互作用影響一些蛋白激酶與蛋白磷酸酶等一系列下游信號分子的產生和參與。越來越多的試驗證據表明，高濃度的H2O2溶液能損傷生物大分子，產生細胞毒害作用[19]，但低濃度的H2O2溶液作為信號分子可以擴散到細胞的各個部位，參與多種生理作用，甚至對植物的生長起到促進作用。

Pb脅迫能夠影響植物體內活性氧代謝系統的平衡，Pb脅迫下，小麥幼苗的根系活力下降，而MDA含量、POD、SOD和CAT活性和微核率均有所上升，這表明重金屬Pb對植物幼苗存在明顯毒害作用，能夠脅迫其生長和代謝。而植物可通過細胞保護酶系統自我調節來抵制逆境脅迫對機體的傷害，作為植物的保護酶系統，POD、SOD、CAT相互協調，SOD催化O2-·生成H2O2和O2；CAT則具有分解H2O2的作用，與SOD協同作用，可以最大限度地減少·OH的形成；POD則能清除細胞內的過氧化物[20]，可以在一定程度上減輕活性氧對植物細胞的傷害。而MDA含量和微核率上升、根系活力下降可表明小麥幼苗受Pb2+脅迫傷害的程度。經0.010 0 mmol/L H2O2預處理后的小麥幼苗POD、SOD、CAT活性均有不同程度地上升，而MDA含量下降，說明外加H2O2溶液降低了小麥幼苗葉片的膜脂過氧化程度，減緩了Pb2+對小麥幼苗的傷害。這表明適量的H2O2能夠增強小麥幼苗抗氧化酶的活性，能夠更快速地清除活性氧自由基，減少積累，降低膜脂過氧化程度，增強小麥幼苗對抗Pb2+脅迫傷害的防護作用，H2O2對Pb2+脅迫下小麥幼苗的防護作用在一定程度上體現在MDA含量的減少。而根系活力的上升及微核率的下降也能說明H2O2除了能增強抗氧化酶活性外，還能通過其他機制增強細胞活性。

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