N⁺輻照與高溫熱激對小麥幼苗抗寒性的影響

張佳佳，代西梅，趙帥鵬

摘要：植物抗寒性是衡量其抗逆性的一個重要方面，以小麥（Triticum aestivum L.）干種子為材料，經低能離子束輻照處理后，常規培養至其三葉期時經42 ℃熱激處理，再經4 ℃冷處理，研究其抗寒性變化。結果表明，在某些離子注入量下幼苗的抗寒性明顯提高，膜傷害程度降低；高溫熱激使得低離子注入量下幼苗的脯氨酸和丙二醛含量比常溫時升高，而高離子注入量下低于常溫；真空高溫處理的幼苗細胞膜傷害最小，說明低能離子注入與高溫熱激共同作用能夠進一步提高植物抗寒性。

關鍵詞：小麥（Triticum aestivun L.）；幼苗；抗寒性； N+輻照；高溫熱激；影響

中圖分類號：S512.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）05-1012-03

Influence of N+ Irradiation and High Temperature Heat Shock on Wheat Seedling

Cold Hardiness

ZHANG Jia-jia，DAI Xi-mei，ZHAO Shuai-peng

（Henan Provincial Key Laboratory of Ion Beam Bioengineering， Zhengzhou University， Zhengzhou 450052，China）

Abstract： The cold hardiness of plants is one of the important aspects to measure its resistance. The dry seeds of wheat （Triticum aestivun cv. Xiaoyan81） were irradiated by low-energy N+， and heat shocked at 42 ℃ at 3-leaves stage to study the dynamics of its hardiness at 4 ℃. The results showed that the cold hardiness of seedling was obviously increased under some ion implantation quantity as the damage of cell membrane reduced. High temperature increased praline and malondialdehyde content in wheat seedlings with low dose of ion implantation compared to those under normal temperature； while decreased with high ion implantation quantity. The cell membrane of seedling treated by vacuum and high temperature had the minimum damage， indicating that combination of low-energy N+ and high temperature could enhance the cold hardiness of plant.

Key words： wheat（Triticum aestivum L.）；seedling； cold hardiness； N+ irradiation； high temprature heat shock； influence

植物的抗寒能力與可溶性糖、膜磷脂、游離氨基酸、膜脂肪酸的飽和度有關[1]，低溫引起的細胞膜結構破壞是導致植物寒害損傷和死亡的根本原因[2]，膜系統功能結構的穩定性是維持和發展植物抗寒能力的基礎。細胞膜是分割細胞內外物質的屏障，具有選擇透性，是細胞與周圍環境進行物質交換的主要通道。細胞膜是細胞感受外界脅迫最敏感的部位，逆境脅迫會使細胞膜選擇透性改變或消失，導致細胞中包括電解質在內的物質大量外漏，使組織浸泡液的電導率變大[3]。電解質的滲出量是衡量細胞膜受損害程度的重要指標之一。植物在逆境中會產生自由基和丙二醛（MDA）等中間產物，丙二醛可以引發或加劇細胞膜脂過氧化作用，對細胞膜有毒害作用[4]，丙二醛含量越高細胞膜的損害程度越大，則細胞膜的透性越強。丙二醛的積累量代表細胞膜脂過氧化的程度，可間接反映植物組織抗氧化能力的大小。脯氨酸是植物蛋白質的組分之一，以游離狀態廣泛存在于植物體中。在逆境條件下植物體內脯氨酸的含量顯著增加。由于脯氨酸親水性極強，能穩定原生質膠體及組織內的代謝過程，因而能降低凝固點，有防止細胞脫水的作用。在低溫條件下，植物組織中脯氨酸增加可提高植物的抗寒性，因此植物體內脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性[5]。黃上志等[6]通過研究熱激對水稻幼苗的影響，認為水稻種子經42 ℃高溫熱激處理后幼苗的耐冷性明顯增強，膜傷害程度降低，脯氨酸及各種保護酶的含量增加，而丙二醛的含量降低。綜上所述，細胞膜結構的損害強度是在植物受逆境脅迫后多種產物共同作用的結果，即植物的抗寒性也是由這些產物共同影響的。

高溫熱激對植物抗寒性的影響已有很多報道[6-8]，而離子束輻照作為一種誘變源，誘變優勢也早已被認同[9]，但是關于離子束輻照與熱激共同作用對抗寒性的影響未見報道。本研究將小麥種子進行離子束輻照，幼苗經42 ℃高溫處理后測定電解質滲出率及丙二醛和脯氨酸的含量，并與常溫條件下的幼苗進行了比較，以研究離子束輻照及高溫熱激對細胞膜的損害程度（抗寒性）的影響，旨在通過研究細胞膜透性的改變來探索植物在不同脅迫下的抗寒性。

1 材料與方法

1.1 材料

供試小麥（Triticum aestivun L.）品種為小偃81。

1.2 試驗設計

選取飽滿均一的小麥種子，用低能氮離子束直接照射種子胚部。使用鄭州大學離子束生物工程省重點實驗室的Titan脈沖式離子注入機在靶室中進行氮離子注入。離子注入能量為30 keV，真空度為5×10-2 Pa，采用脈沖式注入，束流為200 mA。注入量分別設為：真空10 min、1×1016、3×1016、5×1016 N+/cm2，以未注入氮離子的種子為對照。然后將低能氮離子處理好的種子每處理都分為2組，將其種入營養土中，待幼苗長至3葉期時，將其中一組放入42 ℃中培養4 h，另一組25 ℃培養4 h。之后將兩組小麥幼苗都放入4 ℃培養，2 d后再將兩組材料25 ℃恢復生長2 d[6]。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 電解質滲出率 稱取1 g幼苗，放入50 mL錐形瓶中，加入15 mL 0.3 mol/L的甘露醇，去離子水定容到50 mL，25 ℃ 60 r/min振蕩3 h后測定滲出液的電阻率，由此算出電導率。將測量過的帶有幼苗的溶液高溫滅菌20 min，自然冷卻，加去離子水至50 mL，60 r/min振蕩15 min測總電阻率，算出電導率[6]。由公式：電解質滲出率=浸泡液電導率/煮沸后電導率×100%，計算電解質滲出率[3]。

1.3.2 丙二醛含量 取1 g葉片剪碎，加入10%三氯乙酸研磨提取丙二醛，以4 000 r/min離心10 min，取上清液，下一步進行顯色反應及測量。方法及藥品的配制均參照文獻[3]。

1.3.3 脯氨酸含量 取0.5 g葉片剪碎，3%磺基水楊酸研磨，將勻漿移至離心管中沸水浴10 min，冷卻，3 000 r/min離心10 min后取上清液，然后參照文獻[3]測定游離脯氨酸含量。

2 結果與分析

2.1 各處理對細胞膜透性的影響

由圖1可以看出，42 ℃熱激組的電解質滲出率隨氮離子注入量增加呈先上升后下降趨勢，在真空處理達到最低值，3×1016 N+/cm2處理達到最高值；25 ℃組電解質滲出率隨注入量的增加呈現先下降后上升的趨勢，真空處理達最大值， 3×1016 N+/cm2處理達最小值。說明高溫熱激對未經離子注入的幼苗細胞膜具有保護作用，但離子注入后高溫熱激對幼苗細胞膜的作用具有隨機性，真空高溫處理對膜的保護作用較好。

2.2 各處理對脯氨酸含量的影響

從圖2可以看出，隨離子注入量的增加，25 ℃組的脯氨酸含量呈先下降后上升的趨勢，5×1016 N+/cm2處理時達最大值；42 ℃組呈先上升后下降再上升的趨勢，1×1016 N+/cm2處理時達最大值。25 ℃時，真空處理和1×1016 N+/cm2處理脯氨酸含量均低于對照，其他處理均高于對照。以上結果說明熱激在低離子注入量下對幼苗具有保護作用，而在高離子注入量下則有損害作用。42 ℃時，3×1016 N+/cm2處理的脯氨酸含量最小，僅有0.26%，與其他高溫處理組存在明顯差異，這與其電解質滲出率最高結果相一致，說明可能經3×1016 N+/cm2低能氮離子束輻照及高溫處理后，其抗寒性反而下降。

2.3 各處理對丙二醛含量的影響

由圖3可見，25 ℃處理后，幼苗丙二醛含量隨離子束注入量的增加呈上升趨勢，且變化區間較大，真空處理達到最小值，5×1016 N+/cm2處理達到最大值；42 ℃處理后，幼苗丙二醛含量在不同離子束注入量處理下變化不大。說明在低注入量下高溫反而會使丙二醛含量增加，高注入量高溫會使丙二醛含量下降；常溫（25 ℃）下離子注入量對幼苗丙二醛含量影響較大，而高溫后隨離子注入量的變化丙二醛含量變化不明顯，可能是由于高溫熱激在一定程度上修復了離子注入對丙二醛含量的影響。

3 討論

植物受到脅迫后，細胞膜會從液晶狀態變為凝膠狀態，導致膜結構被破壞，膜的透性會增大電解質外漏，從而電解質滲出率增大[2]，因此電解質滲出率的大小能夠粗略地反映植物的抗逆性。前人已通過研究細胞膜的透性研究了植物的抗寒性、抗旱性以及抗鹽堿等，證明膜透性是植物抗逆性的有效指標之一[10]。

本實驗中未經離子束處理的對照組表明高溫熱激可以使細胞膜透性降低，證實了前人所研究的高溫熱激會提高小麥幼苗的抗寒性。小麥幼苗在受到離子束及高溫脅迫后，細胞膜透性在某些注入量下低于不做任何處理的幼苗，說明離子束及高溫脅迫在一定條件下可以提高幼苗的抗寒性。幼苗經真空高溫（42 ℃）、3×1016 N+/cm2常溫（25 ℃）和5×1016 N+/cm2高溫處理后的抗寒能力強于對照，真空高溫處理幼苗抗寒性能力最強，說明此方法是提高植物抗寒性的另一途徑，而這種方法對幼苗抗寒能力的提高比單純高溫熱激效果更好。輻照過的小麥與對照存在差異，可能是因為離子束的輻照誘變使得小麥自由基、保護酶以及脂質過氧化發生改變[9]，從而提高了小麥的抗寒性。高溫能夠提高抗寒性可能是高溫熱激產生的熱激蛋白，熱激蛋白具有參與新生肽的折疊、運輸和組裝及參與逆境損傷蛋白的修復和降解的功能，熱激蛋白的合成能提高植物的抗寒性[6]。

當植物受到脅迫時體內游離脯氨酸含量會發生很大變化。脯氨酸是植物細胞內滲透調節物質，還能夠穩定生物大分子結構、降低細胞酸性、解除氨毒以及作為能量庫調節細胞氧化還原勢等。冷脅迫下脯氨酸迅速增加，作為防脫水劑降低水勢保護植物[11]，幼苗中游離脯氨酸含量越高說明幼苗的抗寒性越強。1×1016 N+/cm2高溫處理的幼苗脯氨酸含量最高，說明此脅迫有助于提高幼苗的抗逆性。而丙二醛是細胞膜脂過氧化作用的產物之一，因此丙二醛的增加則意味著植物抗逆性的降低[12]。5×1016 N+/cm2常溫處理下幼苗的丙二醛含量最高，則幼苗抗逆性最低。

本研究中細胞膜的電解質滲出率的變化趨勢與脯氨酸及丙二醛的變化并不完全一致，這可能是由于細胞膜的透性與膜脂過氧化和膜脂肪酸以及植物體內各種生理指標相聯系，而脯氨酸與丙二醛僅是眾多影響因素之一，因此細胞膜的損傷程度并不能完全依賴這二者來判斷。

綜上所述，離子束輻照與高溫熱激對幼苗抗寒性的影響隨離子注入量的變化有一定的變化，但在某個適合幼苗生長的脅迫下（如真空高溫），幼苗的抗寒性高于僅進行高溫脅迫的幼苗，此研究為選育具有更強抗寒性能作物提供了新的途徑。

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