MTT法測定棉酚對多浪羊淋巴細胞生長的影響

王娟娟，賈山嶺，萬新軍，李蓮瑞

摘要：通過MTT法測定棉酚對多浪羊淋巴細胞生長的影響，確定棉酚對多浪羊淋巴細胞產生影響的最短作用時間和最低濃度，用于指導生產實踐。從新疆多浪羊外周血分離淋巴細胞，將其加入10 mL的 RPMI-1640中，均勻加入96孔細胞培養板中，于CO2 培養箱中37 ℃培養12 h后，分別以不同濃度（5、10、15、20、25、30、35 μmol/L）的棉酚進行作用，作用時間分別為1、2、3、4、5、6 h，加入MTT培養4 h，加入DMSO溶液終止反應，用酶聯免疫檢測儀于490 nm處檢測各孔的吸光值。結果表明，隨著棉酚作用濃度及作用時間的遞增，多浪羊淋巴細胞活性在逐漸下降，說明棉酚對多浪羊的淋巴細胞活性有明顯的抑制作用。

關鍵詞：MTT；棉酚；新疆多浪羊；淋巴細胞；影響

中圖分類號：S816.43 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）05-1098-04

The Effect of Gossypol on Lymphocyte Growth of Duolang Sheep by MTT

WANG Juan-juana，JIA Shan-linga，WAN Xin-junb，LI Lian-ruib

（Tarim University， a.College of Life Science； b.College of Animal Science， Alar 843300， Xinjiang，China）

Abstract： The effect of gossypol on the growth of Duolang sheep lymphocyte was detected by MTT assay. The object was to determine the shortest time and lowest concentration of gossypol on lymphocyte， and then used to practice. The lymphocyte was isolated from the peripheral blood of Xinjiang Duolang sheep， then added into 10 mL RPMI-1640 and even allocated to 96-well cell culture plate. After cultured in CO2 incubator at 37 ℃ for 12 h， the lymphocytes were treated with gossypol of different concentrations （5， 10， 15， 20， 25， 30， 35 μmol/L） for 1， 2， 3， 4， 5， 6 h， and then added MTT to culture 4 h. At last the reaction was stopped by adding DMSO solution. The absorbance of each well was detected by ELISA at OD490 nm . The results showed that the activity of Duolang sheep lymphocytes decreased with the increase of gossypol concentration and acting time. It indicated that gossypol had obvious inhibitory effect on the Xinjiang Duolang sheep lymphocytes.

Key words： MTT； gossypol； Xinjiang Duolang sheep； lymphocyte； effect

棉酚（Gossypol，GL）存在于錦葵科某些植物的根、莖、種子中，曾作為男性節育藥為人們所熟知[1]。研究表明，棉酚還是一種新型的抗實體瘤藥物[2]，化學結構為8，8′-二醛基-1，1，6，6′，7，7′-六羥基-5，5′-二異丙基-3，3′-二甲基-2，2′聯萘，相對分子質量為518.54[3]，棉酚制劑主要有3種，分別為醋酸棉酚、精制棉酚及甲酸棉酚。棉酚具有明顯的誘導腫瘤細胞凋亡的能力[4，5]。據統計，2010年新疆棉花產量為260萬t，約占全國棉花總產量的40%，世界棉花總產量的11%。根據俄羅斯農業科學院有機化學研究所的一個科學小組研究發現，以往被人們認為廢棄物的棉花的其他部分也是寶貴資源，利用其可生產出大約1 200種制劑、提煉出100多種有機化合物，同時也是畜禽飼料方面的好原料[6]；另外棉子餅同大米和小麥相比，不僅蛋白質含量高出5～8倍，棉子餅水解后還可得到17種氨基酸，是畜牧業生產中最物美價廉的蛋白質來源[7]，這就為新疆的農牧民提供了大量廉價的飼料資源，尤其是在新疆畜牧業的快速發展、蛋白質飼料短缺的局面越來越嚴重的情況下，大量廢棄的棉子殼無疑是廣大農牧民極為廉價的優質飼料。但由于棉子殼中含有棉酚類物質，當達到一定量時，會對動物機體產生毒害作用。研究棉酚引起動物細胞和組織中毒的最小劑量，對于最大限度地降低由于棉酚中毒而給畜牧業帶來的損失具有重要的作用。

MTT比色法是一種檢測細胞存活和生長的方法，其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能，二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在490 nm波長處測定其光吸收度值，可間接反映活細胞數量。因此運用MTT法研究棉酚對新疆多浪羊淋巴細胞生長的影響能夠為我們更進一步研究棉酚對細胞產生的影響提供重要的參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 多浪羊（Duolang sheep）由塔里木大學動物科技學院試驗站提供。

1.1.2 試驗藥劑 青霉素（山西泰盛制藥有限公司），鏈霉素（新泰生物有限公司），枸櫞酸鈉（塔里木大學畜牧科技學院重點實驗室配制），人淋巴細胞分離液（中國醫學科學院生物工程研究所）、MTT（噻唑藍，上海普飛生物技術有限公司）；DMSO（二甲基亞砜，Sigma公司），RPMI-1640培養基（Gibco），PBS緩沖液。

1.1.3 儀器設備 電子天平（BS124S，北京市賽凝膠多利斯儀器系統有限公司）；超凈工作臺（SW-CJ-2F型，上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；全自動攝影生物顯微鏡（DP70+B10-OlysLIA，日本奧林巴斯）；電子萬用爐（DL-1型，北京永光明醫療儀器廠）；紫外可見分光光度計（Golds54型，上海棱光技術有限公司）；PCR儀；電泳槽（DYCZ-28A ，北京六一儀器廠）；電腦三恒多用電泳儀（DYY-60C型，北京六一儀器廠）；凝膠成像分析系統（Tanon-4100，上海天能科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 試劑的配制

1）MTT的配制：稱取0.5 g MTT，加入 100 mL的PBS磷酸緩沖液（NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 1.44 g，KH2PO4 0.24 g，調節pH 為7.4，定容至1 L，用0.22 μm濾膜過濾除去溶液里的細菌，于4 ℃儲存備用），配成濃度為5 mg/mL的 MTT儲存液，于-20 ℃冰箱避光儲存（注意：MTT變為灰綠色時就絕對不能再用了，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解）。進行試驗的時候一般關閉超凈工作臺上的日光燈來避光較好。

2）RPMI-1640的配制：稱取 0.062 5 g 青霉素（160 IU），0.1 g鏈霉素（100 IU），用10 mL滅菌蒸餾水溶解。將青霉素、鏈霉素混合液與RPMI-1640 （袋裝粉劑）混合，滅菌蒸餾水定容至1 000 mL，調節pH至7.1左右，分裝后于-20 ℃以下保存。

3）枸櫞酸鈉溶液配制：枸櫞酸鈉3.8 g溶于100 mL滅菌蒸餾水中。

4）無鈣鎂Hanks液配制：①儲存液：NaCl 0.80 g；KCl 0.4 g；Na2HPO4·12H2O 0.152 g； KH2PO4 0.06 g；葡萄糖0.10 g。將稱量好的藥品加滅菌蒸餾水，使各組分溶解后，加入0.4 %酚紅溶液50 mL，加滅菌蒸餾水定容至100 mL，4 ℃冰箱保存。②應用液：臨用前將原液用滅菌蒸餾水做10倍稀釋，用無菌的5.5%的NaHCO3調節pH至7.2～7.4（配制時應注意所用的玻璃器皿必須潔凈；各種藥品稱量應準確，要求用分析純試劑；儲存液可加入2 mL氯仿以抑制細菌生長，儲存液配好后，瓶口須用橡皮塞塞緊，放4 ℃冰箱內保存，使用期最長為3個月；應用液配好后，經高壓滅菌，4 ℃冰箱內保存，可供1個月內使用，用前需再次調整pH）。

1.2.2 MTT試驗原理 活細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能夠代謝還原MTT，同時在細胞色素C的作用下，生成藍色（或藍紫色）不溶于水的甲瓚（Formazan），甲瓚的多少可以用酶標儀在490 nm處進行測定。在通常情況下，甲瓚生成量與活細胞數成正比，因此可根據吸光度值推測出活細胞的數目。由于死細胞中不含琥珀酸脫氫酶，加入MTT后不會出現類似的反應，根據其對應的值就可反映出活細胞的相對情況。

1.2.3 試驗步驟

1）淋巴細胞的分離。采集健康成年多浪羊新鮮抗凝血與Hanks液等比例混勻，然后將混合液與淋巴細胞分離液按體積比2∶1混合后輕輕沿管壁加入玻璃管中，以2 000 r/min離心30 min后，可看見清晰的分層，分別為血漿層、淋巴細胞層、分離液層、紅細胞層，用移液器小心將淋巴細胞層吸出，然后將淋巴細胞懸浮于10 mL RPMI-1640中輕輕混合均勻，分別依次加入96孔板中。

2）不同濃度棉酚作用于多浪羊淋巴細胞。將用DMSO（二甲基亞砜）助溶的50 mmo/L的棉酚儲存液取出，將其加入RPMI-1640稀釋的淋巴細胞懸液中，為確保棉酚的作用時間分別為1、2、3、4、5、6 h，而MTT的作用時間為4 h，從96孔板的右邊第11、12列開始加入棉酚，從上到下（即第1排到第8排，下同）依次加入棉酚，使得棉酚的終濃度分別為0、5、10、15、20、25、30、35 μmol/L，然后放入37 ℃、CO2濃度為5%的細胞培養箱中培養，此時加入棉酚以確保棉酚對新疆多浪羊淋巴細胞的作用時間為6 h。

在第二小時的時候，將96孔板細胞培養板從CO2培養箱中取出，按上述方法在第9、10列加入棉酚，終濃度按從上到下分別為0、5、10、15、20、25、30、35 μmol/L ，此時加入棉酚以確保棉酚對新疆多浪羊淋巴細胞的作用時間為5 h，然后將96孔細胞培養板放入37 ℃、CO2濃度為5%的細胞培養箱中繼續培養。

在第三小時的時候，按上述方法在第7、8列加入棉酚，此時可確保棉酚對新疆多浪羊淋巴細胞的作用時間為4 h。此時，將配制好的5 mg/mL的 MTT儲存液取出，用排槍從96孔板從右往左每孔加入20 μL MTT溶液，這是MTT與細胞作用的第一小時，然后再將96孔板放入37 ℃、CO2濃度為5%的細胞培養箱中繼續培養。

在第四小時的時候，依照上述方法，在第5、6列加入棉酚，使棉酚的終濃度分別為0、5、10、15、20、25、30、35 μmol/L，此時，MTT的作用時間為2 h。同樣，第五和第六小時也按照上述方法加入棉酚，這樣，既確保了棉酚的作用時間分別為1、2、3、4、5、6 h，也可以保證MTT的作用時間達到4 h，然后放入37 ℃、CO2濃度為5%的細胞培養箱中培養。

3）DMSO終止培養。每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在490 nm處測量各孔的吸光值。每個時間點各設2個重復，同時設空白對照。

2 結果與分析

2.1 棉酚對新疆多浪羊淋巴細胞生長的影響

2.1.1 棉酚不同作用時間對新疆多浪羊淋巴細胞活性的影響 從表1和圖1中可以看出，隨著棉酚作用時間的遞增，新疆多浪羊淋巴細胞吸光度值在2 h以內呈現遞增趨勢，并在2 h時達到峰值。2 h以后，隨著時間的進一步遞增，新疆多浪羊淋巴細胞的吸光度值呈現遞減的趨勢，且均小于對照。這是由于活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中（死細胞無此功能），所以，MTT所測得的吸光度值越大，表明其活細胞的含量越高，活性越強。試驗結果表明棉酚在作用2 h的時候，新疆多浪羊淋巴細胞的活性最大，隨后，由于棉酚進入細胞，長時間的作用對細胞造成了損傷，細胞自身的修復作用并不能維持其自身活性，其酶活力下降，甚至有大量的細胞出現了凋亡。

2.1.2 棉酚不同作用濃度對新疆多浪羊淋巴細胞活性的影響 圖2為不同作用濃度的棉酚對新疆多浪羊淋巴細胞吸光度值的影響結果。由圖2可見，在棉酚濃度為5～15 μmol/L的范圍內，新疆多浪羊淋巴細胞吸光度值表現為遞增，且在15 μmol/L的濃度下達到最大，以后則一直呈現遞減，在35 μmol/L的棉酚濃度下，其吸光度值達到了最低。這主要是因為在棉酚濃度為5 μmol的時候，對新疆多浪羊淋巴細胞產生較大程度的損傷，但是隨著其濃度的遞增，新疆多浪羊淋巴細胞本身的免疫系統會隨著外源不利因素的遞增而出現自身功能性的修復作用，此時細胞的活性會增強，代謝能力也會加強，同時，隨著棉酚作用時間的遞增，新疆多浪羊淋巴細胞在CO2培養箱中也會生長，尤其是在新疆多浪羊淋巴細胞的對數生長期，其細胞個數會增多，體積會變大，所以相應細胞活力也會增強，活細胞的個數也會增多，此時新疆多浪羊淋巴細胞的吸光度值就會出現短暫的遞增。但隨著棉酚濃度的進一步增大，對新疆多浪羊淋巴細胞的損傷程度也達到了最大，其自身的修復作用已經不能維持正常的生理活動，此時測得的吸光度值就會遞減，且在35 μmol/L的濃度下其吸光度值達到最低。

2.2 分析

在棉酚不同濃度及不同時間作用下，棉酚對新疆多浪羊外周血淋巴細胞產生了不同的影響。本試驗結果表明，隨著棉酚作用濃度的增大，在2 h作用時間范圍內，新疆多浪羊外周血淋巴細胞的吸光度值是逐漸增大的，而在2 h以后，新疆多浪羊外周血淋巴細胞的吸光度值遞減，說明在2 h內新疆多浪羊淋巴細胞的活性還能維持自身的生長需要，2 h以后則會影響新疆多浪羊淋巴細胞的正常生理功能。而在大于15 μmol/L的棉酚濃度下，會使新疆多浪羊淋巴細胞喪失某些生理功能，活細胞的個數減少，部分生理機能也會喪失。從總體的趨勢來看，棉酚的作用時間應該控制在2 h以內、濃度控制在15 μmol/L的范圍以內，否則可能會對新疆多浪羊的生理機能產生一定的影響。

3 討論

Kainz等[8]提出，棉酚是一種抑制劑，不僅會抑制DNA的合成，對于RNA及蛋白質的合成都具有明顯的抑制作用，Balakrishnan等[9]的試驗也證明棉酚作為一種BH3類物質，通過與抗凋亡蛋白的結合誘導慢性淋巴細胞白血病細胞的凋亡，并且也有研究證明棉酚可以引起心肌細胞內質網擴張并且使溶酶體的數量增加[10]。在本試驗中，隨著棉酚濃度的加大和作用時間的延長，新疆多浪羊外周血淋巴細胞的酶活力值越來越小。甲瓚類物質的作用原理是通過MTT作用于（細胞）線粒體，采用酶聯免疫檢測儀檢測其酶活力的大小，可在一定程度上反映棉酚對細胞的損傷情況。可將其作為在飼喂動物棉子殼時的參考依據之一。棉酚也可以作為雌性動物生殖的抑制劑，在牛的黃體細胞培養中，10 μg/mL的棉酚可以抑制hCG刺激的孕酮合成及cAMP合成，并且會與細胞膜相結合。大鼠體外受精卵的培養中，濃度為3～30 μg/mL的棉酚可以明顯降低發育到二原核期的卵細胞數，當棉酚的濃量達到一定程度，尤其是大劑量的棉酚會擾亂雌性動物的動情周期，阻止受精卵的發育[11，12]，并且其著床率也會大大降低。有報道稱棉酚對卵巢內分泌及子宮和胚胎均具有一定的毒性[13]。此外，棉酚能與蛋白質中賴氨酸的s-氨基酸結合，可大大降低賴氨酸的有效成分，降低其營養價值。因此本試驗結果對于以棉子殼作為家畜主要飼料的農牧地區具有重要的參考作用。

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