好氧反硝化細菌的篩選

何為，張岳驍，李永紅

摘要：采集江安河及府河淤泥樣本，采用BTB培養基與N-（1-萘基）-乙二胺光度法篩選出20株具有反硝化能力的好氧菌株。選取其中5株反硝化能力較強的DM1、DM2、DM3、DM4和DM5菌株，進行NO3--N去除率測定，其48 h NO3--N去除率均達到了30%以上。其中DM1、DM2、DM3和DM5菌株氮去除率依次為43.9%、47.6%、47.9%和51.3%。對DM5菌株進行生長曲線測定，進行pH值和溫度對反硝化速率影響測定，試驗結果表明在pH 7.0～7.4，溫度20～30 ℃時，DM5菌株反硝化效果較好。

關鍵詞： 好氧；反硝化細菌；分離；反硝化效率

中圖分類號：Q936 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）05-1053-04

Screening of Aerobic Denitrifying Bacteria

HE Wei，ZHANG Yue-xiao，LI Yong-hong

（College of Chemical Engineering， Sichuan University， Chengdu 610225， China）

Abstract： By using BTB medium and N-（1-naphthyl）-ethylenediamine photometry， twenty aerobic strains that were capable of denitrification were isolated from the silt samples of JIANG AN river and FU river. Being more capable， five individuals numbered as DM1， DM2， DM3， DM4 and DM5 of the above strains were selected to determine the nitrate removal rate. The results of determination of aerobic denitrifying activity showed that the nitrate removal rate of all the five strains was more than 30%. And the nitrate removal rate of DM1，DM2，DM3 and DM5 was 43.9%，47.6%，47.9% and 51.3% respectively. The determination of the DM5 growth curve as well as the influence of the pH value and temperature on denitrification rates showed that when the pH value range for DM5 was 7.0～7.4 and the temperature was between 20 ℃ and 30 ℃， the efficience of nitrogen removal was better.

Key words： aerobic； denitrifying bacteria； screening； nitrate removal rate

工業生產中未經處理的含氮廢水的排放造成了我國河流、湖泊及海洋氮含量普遍增高，進一步導致湖泊富營養化、海洋赤潮等現象，極大地危害到水生物的生存繁衍以及人類自身的健康。此外，農用氮肥的使用加大了地下水硝酸鹽污染程度，硝酸鹽可在一定條件下轉化為亞硝酸鹽，而亞硝酸鹽極易致癌，危害人們生命。我國地下水合格率僅為30%[1]，因此，探究高效經濟的脫氮工藝迫在眉睫。

傳統的物化脫氮法包括吹脫法[2]、MAP沉淀法、膜法、折點加氯法和離子交換法，主要用于高濃度含氮廢水處理，而對于低濃度含氮廢水而言其成本相對過高，而運用新型生物脫氮法進行低濃度廢水處理則優勢明顯。現階段生物脫氮法主要包括活性污泥法[3]、固定化生物脫氮[4]以及微生物制劑[5]等，其理論技術都趨于成熟，然而其前提條件是找到一種反硝化效率較強的菌株。

本研究以江安河和府河淤泥為基礎，以硝酸鉀為惟一氮源，以梯度劃線法和BTB平板篩選等方法相結合進行好氧反硝化細菌的篩選，得到反硝化效率較高的菌株，并對所得菌株反硝化能力進行pH值以及溫度影響的評估，以得到菌株最適的反硝化條件，為生物脫氮提供新的菌種選擇依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 從江安河和府河采取污泥樣本進行菌株篩選以及反硝化性能的研究。

1.1.2 培養基及試劑 LB液體培養基（1 L）：KNO3 1.00 g、KH2PO4 1.00 g、FeCl2·6H2O 0.05 g、CaCl2·7H2O 0.02 g、MgSO4·7H2O 1.20 g、琥珀酸鈉8.60 g，1×105 Pa滅菌20 min；BTB初篩培養基[6] （1L）：瓊脂20.00 g、KNO3 1.00 g、KH2PO4 1.00 g、FeCl2·6H2O 0.50 g、CaCl2·7H2O 0.20 g、MgSO4·7H2O 1.20 g、琥珀酸鈉8.50 g、溴百里酚藍（BTB）（1%乙醇溶液）1 mL，用1 mol/L的NaOH調節pH至7.0～7.3，1×105 Pa滅菌20 min；DM反硝化培養基（1 L）：KNO3 0.72 g、KH2PO4 1.00 g、MgSO4·7H2O 1.00 g、琥珀酸鈉4.30 g，1×105 Pa滅菌20 min；鹽酸N-（1-萘基）-乙二胺光度法[7]所用試劑：鹽酸溶液和對氨基苯磺酸溶液；紫外分光光度法[8]所用試劑：鹽酸溶液和氨基磺酸銨溶液。

1.2 方法

1.2.1 細菌富集 取適量江安河和府河淤泥分別加入盛有50 mL LB液體培養基的250 mL三角瓶中，在溫度為30 ℃、搖床轉速為180 r/min的條件下培養48 h。

1.2.2 細菌初篩 吸取適量富集后的培養液，分別進行104、105、106及107倍稀釋。用移液器分別吸取稀釋后的培養液0.1 mL均勻涂布于BTB固體培養基上，在溫度為30 ℃的條件下培養48 h。由于反硝化過程中NO3-還原會使培養基的pH值升高，試驗中所用的選擇性培養基（BTB初篩培養基）所含的產堿指示劑溴百里酚藍能夠準確地指示這一變化，而顯現出藍色，因此選取使周圍培養基出現藍色暈圈的單菌落作為初篩菌株。

1.2.3 細菌復篩 將上述初篩得到的菌株，用接種環在無菌條件下接種到盛有50 mL DM反硝化液體培養基的250 mL的三角瓶中，在溫度為30 ℃、搖床速率為180 r/min的條件下培養48 h。再將培養后的菌株接種到新鮮的DM反硝化液體培養基中，在同樣條件下培養48 h。重復上述步驟4次，可基本得到純化菌株。利用鹽酸N-（1-萘基）-乙二胺光度法檢測培養液中是否有NO2-產生。選取變紅的細菌培養液進行NO3-含量測定，得到能使NO3-明顯降低的菌株作為復篩菌株。將復篩后得到的菌株接種于DM反硝化斜面，保存于4 ℃冰箱中。

1.2.4 好氧反硝化細菌反硝化速率測定 菌懸液的制備：從斜面中，用接種環接一環細菌于裝有20 mL DM反硝化培養基的100 mL三角瓶中，在溫度為25 ℃、搖床轉速為160 r/min條件下培養16 h后，保存于4 ℃冰箱。在盛有20 mL新鮮DM培養基的100 mL三角瓶中接入0.5 mL上述菌懸液，在溫度為25 ℃、搖床轉速為160 r/min條件下培養。以未接種菌株的DM液體培養基作為對照，每隔24 h測定NO3-濃度，連續檢測48 h。檢測方法為紫外分光光度法，所用儀器為北京普析通用儀器有限責任公司生產的TU-1810紫外分光光度計。以上試驗均設置2個平行樣，最終數據取平均值。

1.2.5 好氧反硝化細菌生長曲線測定 移取1 mL細菌菌懸液于盛有100 mL新鮮DM培養基的500 mL三角瓶中，在溫度為25 ℃，搖床轉速為160 r/min的條件下培養。以未接種菌株的DM培養基作為對照，培養6 h后，每隔4 h取一次樣。用TU-1810紫外分光光度計于波長540 nm處測定其光密度值。利用細菌濃度與光密度值成正比的關系，繪制光密度值和時間的關系曲線，即為細菌生長曲線。

1.2.6 pH對好氧反硝化細菌反硝化效率的影響測定 分別移取0.5 mL細菌菌懸液接種于pH為3.0、5.0、7.0、8.0、9.0及11.0盛有50 mL新鮮DM培養基的250 mL三角瓶中，在溫度為25 ℃、搖床速率為160 r/min的條件下振蕩培養48 h后，用紫外分光光度法檢測培養液中NO3--N濃度。

1.2.7 溫度對好氧反硝化細菌反硝化效率的影響測定 將細菌菌懸液以0.5 mL的含量接種于盛有50 mL新鮮DM反硝化培養基的的250 mL三角瓶中，分別在溫度為15、20、25、30及45 ℃條件下培養。48 h后，用紫外分光光度法檢測培養液中NO3--N濃度。

2 結果與討論

2.1 好氧反硝化細菌篩選結果

從江安河和府河淤泥中初篩得到能使BTB培養基變藍的菌株30株，且均是從稀釋106倍的涂布平板得到，其中江安河淤泥中篩選得到菌株18株，府河淤泥中篩選得到菌株12株。為保證菌株的單一性，之后對上述試驗得到的菌株進行了5次DM液體培養基純化。復篩時，培養液中分別滴加對氨基苯磺酸溶液和鹽酸N-（1-萘基）-乙二胺溶液，培養液能變紅的細菌菌株共20株。其原理在于反硝化過程中會生成亞硝酸鹽，而亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸生成重氮鹽，再與N-（1-萘基）-乙二胺偶聯生成紅色染料。因此這也證明了這20株菌在好氧情況下能夠進行反硝化過程的第一步，確實是我們需要篩選得到的細菌。為了進一步明確菌株的反硝化作用效果，試驗利用紫外分光光度法測量NO3--N濃度，得到能使其明顯降低的細菌菌株16株，篩選得到降解硝酸鹽能力較強的細菌菌株5株，編號分別為DM1、DM2、DM3、DM4及DM5。

試驗發現反硝化能力較強的5株好氧反硝化細菌均篩選自江安河的淤泥中，并且在DM反硝化液體培養基中培養時發現培養液均會變為綠色粘稠狀，但顏色程度有所不同（圖1），上述結果與李永勇等[9]的研究結果相似。

2.2 好氧反硝化細菌DM5的形態特征

將篩選得到的DM5菌株在平板上劃線，于25 ℃的恒溫培養箱中培養48 h，其結果如圖2所示，菌株呈乳黃色，光滑濕潤，易挑取。對DM5菌株進行電鏡觀察，發現DM5菌株大小約為0.3～0.5 μm×0.8～0.9 μm（圖3）。進一步對DM5菌株進行生理生化試驗，初步鑒定其為銅綠假單胞菌屬（P. Aeruginosa）。

2.3 好氧反硝化細菌的反硝化效率

利用紫外分光光度法，首先繪制NO3-標準曲線（圖4），試驗以最終篩選的5株細菌為研究對象，進行NO3-去除效率的測定，得到其48 h后的反硝化結果（圖5）。由圖5可知，其中DM5菌株反硝化效率最高，其NO3-的去除率為51.3%，DM1、DM2及DM3的NO3-去除率均在40%以上。

在試驗具體操作過程中，由于紫外分光光度法只適合于低濃度的NO3-含量的檢測，因此在進行好氧反硝化細菌培養液的NO3-檢測時，本試驗將培養液上清液進行了50倍稀釋。此外由于試驗過程中細菌培養液均有不同程度的綠色，會極大地影響硝酸鹽氮含量檢測的準確性，因此本試驗進行了脫色，并且由于傳統的氫氧化鋁懸浮液脫色法試劑難以配制，試驗改用氫氧化鋅法脫色，取得了較好效果。由于是好氧反硝化細菌，為了增加溶解氧，試驗過程中采用4層紗布封口，并以速率為160 r/min進行搖床培養，提高了氧傳遞效率，充分滿足了好氧條件。試驗證明所篩選菌株在48 h內即可去除大部分NO3-，從而具有較高脫氮效率。將此類菌株應用于廢水處理過程中，在通過縮短工作周期提高脫氮效率方面有很大的優勢和實際應用價值。

2.4 好氧反硝化細菌DM5的生長曲線

由于細菌濃度與細菌培養液的OD值成正比，試驗通過測定培養液在540 nm處的OD值繪制DM5菌株的生長曲線（圖6）。細菌生長周期分為延遲期、對數生長期、穩定期以及衰亡期，由圖6可知，DM5接種后的對數生長期從16 h開始，從25 h開始進入穩定期，從40 h開始進入衰亡期。由黃運紅等[10]對反硝化作用主要發生時間的分析知，反硝化作用時間主要集中在對數生長期，DM5在16～25 h期間即可從很大程度上發揮反硝化作用。

2.5 pH對好氧反硝化細菌DM5反硝化效率的影響

細菌生長代謝均有最適的pH，低于或者高于此值，其代謝活動便會受到抑制。試驗以DM5菌株為研究對象，在不同pH值、相同溫度以及相同搖床速率的條件下探究pH對其反硝化效率的影響。由結果（圖7）可知，當pH在7.0時，NO3--N濃度降低最多，當pH為弱堿性時反硝化效率較pH呈酸性時要高，其結果與黃廷林等[11]的研究結果相似。因此在實際應用中應避免在酸性及強堿性條件下處理含氮廢水，以免細菌不能發揮其應有的作用。

2.6 溫度對好氧反硝化細菌DM5反硝化效率的影響

溫度的升高會提高細菌內部酶活性，從而提高細菌代謝速率，而當溫度高于某一值時，酶活性反而會受到抑制甚至失活。試驗將DM5菌株置于不同溫度下培養，檢測培養溫度對DM5菌株反硝化效率的影響。由結果（圖8）可知，當溫度為20～30 ℃時，DM5菌株反硝化效率較高，NO3--N的去除率均在40%以上，表明所篩選的菌株具有較寬的適宜溫度范圍；而當溫度不在此范圍內時，NO3--N去除率明顯降低。由于是在恒溫培養箱中進行培養，DM5菌株的反硝化效率與在相同溫度下的搖床中培養相同時間的反硝化效率相比稍有降低，這也進一步驗證了該細菌的好氧性。

3 結論

本研究以硝酸鉀為惟一氮源，琥珀酸鈉為惟一碳源，利用稀釋法以及BTB篩選培養基，從江安河中篩選得到去氮能力較強的5株菌株，編號為DM1、DM2、DM3、DM4及DM5。其中DM4菌株脫氮效率為30%，DM1、DM2以及DM3菌株脫氮效率均達到40%以上，DM5菌株達到50%以上。整個試驗過程均在好氧情況下進行，篩選得到的細菌均是好氧菌株，與傳統的厭氧或微氧脫氮相比，好氧脫氮時間更短，效率更高，更易進行工業化。

通過對DM5菌株的形態以及生理生化試驗，初步判定其為銅綠假單胞菌屬。對DM5菌株脫氮效率進行pH及溫度影響研究，結果發現當溫度為20～30 ℃、pH 7.0時，其脫氮效率較高。此外，DM5菌株在微堿性環境下比在酸性條件下脫氮效率要高。

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