緩釋阿侖膦酸鈉對新骨形成的影響

[摘要] 目的 探討阿侖膦酸鈉（ALN）對體內(nèi)成骨的影響。方法 選擇3月齡SD大鼠20只，在每個(gè)顱骨上制備4個(gè)極限全層骨缺損，分別填入納米羥基磷灰石（HA， A組），納米羥基磷灰石-阿侖膦酸鈉（HA-ALN），依據(jù)ALN質(zhì)量比例分為B組（1 mg/g）、C組（2 mg/g）、D組（4 mg/g）。術(shù)后2周、4周、8周和12周各隨機(jī)處死5只。切取顱骨做大體觀察，X線檢測及組織學(xué)觀察，比較兩組缺損修復(fù)情況。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。結(jié)果 術(shù)后2周，實(shí)驗(yàn)組和對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），術(shù)后4周兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組優(yōu)于對照組，術(shù)后8周和12周組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 nHA-ALN在體內(nèi)促進(jìn)骨缺損修復(fù)效果優(yōu)于nHA，以2 mg/g組效果最顯著。

[關(guān)鍵詞] 阿侖膦酸鈉；納米羥基磷灰石；骨缺損

[中圖分類號] R683；R580 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2013）01（c）-0001-02

骨量不足及骨缺損，是臨床難題之一。ALN已經(jīng)用于臨床治療骨質(zhì)疏松多年，國內(nèi)外大量體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在一定濃度下，其對破骨細(xì)胞有抑制作用，同時(shí)對成骨細(xì)胞有促進(jìn)作用，可以推測ALN在一定濃度下具有促進(jìn)成骨作用。然而體內(nèi)外的生理環(huán)境差異較大，因此該實(shí)驗(yàn)以納米羥基磷灰石（nHA）為載體，制備緩釋體系，直接探討該藥物在體內(nèi)對骨缺損修復(fù)的影響。該研究于2011年12月—2012年5月在濱州醫(yī)學(xué)院煙臺校區(qū)進(jìn)行。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

清潔級3月齡SD雄性大鼠，nHA為納米級粉末，ALN白色粉末，純度>99.9%。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 nHA-ALN的制備 將清洗并消毒nHA倒入一定量超純水中，超聲波清洗機(jī)80 W，40 kHz，1.5 h，加入適當(dāng)質(zhì)量的ALN，漩渦振蕩器震蕩3 min，真空干燥成粉末。

1.2.2 手術(shù)步驟 3月齡SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。40 g/L水合氯醛以10 mL/kg體重腹腔注射麻醉。固定大鼠，常規(guī)顱頂備皮消毒，自眼眶后緣至耳后緣沿正中線剪開皮膚及皮下組織，沿中線剪開骨膜并剪除術(shù)區(qū)骨膜。在無菌生理鹽水冷卻下，用牙科鉆機(jī)做4個(gè)直徑5 mm全層骨缺損，缺損之間間隔2～3 mm，勿損傷硬腦膜。4個(gè)缺損分別填充nHA （A組）和 nHA-ALN，其中nHA-ALN以ALN的質(zhì)量比例分為3個(gè)組：B組（1 mg/g）、C組（2 mg/g）、D組（4 mg/g）。高度與周圍組織面平齊，提拉創(chuàng)口邊緣皮膚，嚴(yán)密縫合。術(shù)后常規(guī)應(yīng)用抗生素。

1.2.3 大體觀察 術(shù)后2周、4周、8周和12周分別處死5只大鼠，完整切取顱骨，觀察缺損愈合情況和新生骨質(zhì)地。

1.2.4 X線檢測 取出顱骨后，即刻拍攝X線片，調(diào)整放射源，使放射源距離感光片40 cm，放射量為0.70，使X線垂直穿透顱骨。

1.2.5 組織學(xué)觀察 4%多聚甲醛固定24 h，流水沖洗12 h，5%HNO3脫鈣至針刺入軟組織，梯度酒精脫水包埋，制作5 um厚切片，HE染色，中性樹膠封片。100倍鏡下每個(gè)時(shí)間段每張片子隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算新生骨占視野的百分比。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0進(jìn)行析因設(shè)計(jì)統(tǒng)計(jì)分析和單因素方差分析，數(shù)據(jù)以（x±s）形式表示。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

術(shù)后2周，缺損邊緣參差不齊，組間無明顯差異，未見明顯縮小；術(shù)后4周，新生骨組織較多，硬度較正常骨組織低，C組缺損面積明顯小于其他組；術(shù)后8周和12周，缺損面積進(jìn)一步縮小，C組缺損始終小于其他組，C組有缺損完全閉合者，A組未出現(xiàn)。

2.2 X線檢測

術(shù)后2周，組間缺損無明顯區(qū)別，缺損邊緣變模糊，不規(guī)則；術(shù)后4周、8周和12周，缺損逐漸修復(fù)，C組修復(fù)速度快于其他組。術(shù)后12周，部分C組僅X線可見缺損痕跡。

2.3 組織學(xué)觀察

術(shù)后2周，各組剩余缺損面積組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；術(shù)后4周，A組與C組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.040），C組與D組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.043），其他組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后8周和12周，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

整體統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，濃度因素有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.656， P=0.005），A組與C組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），C組與D組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.043），B組與C組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.056），其他組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

ALN是臨床上用于治療骨質(zhì)疏松藥物的有效成分，其基本原理是ALN進(jìn)入體內(nèi)后快速吸附并沉積于骨缺損邊緣，與暴露的羥基磷灰石結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞活性，減少骨量丟失。以往大量實(shí)驗(yàn)采用多次注射或頻繁口服給藥，較為繁瑣，而且口服ALN的吸收利用率僅為1%左右，造成藥物的極度浪費(fèi)，口服注意事項(xiàng)較多，并存在燒傷食道等嚴(yán)重并發(fā)癥。所以，本實(shí)驗(yàn)采用一次性緩釋給藥和同一動物左右兩側(cè)的對照，既避免了吸收率不一引起的最終給藥量不同和繁瑣的程序，又排除了個(gè)體差異造成的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)偏倚。

另有關(guān)研究顯示，nHA-ALN復(fù)合材料具有特殊的緩釋性能，實(shí)現(xiàn)化學(xué)結(jié)合后幾乎不以溶出的方式釋放藥物，只有最初24小時(shí)釋放少量處于游離狀態(tài)的ALN，之后不再釋放[1]，在新骨生成并礦化的過程中，ALN隨著nHA的被利用而發(fā)揮其藥理作用，增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性，加速新骨形成，從而縮短骨缺損的修復(fù)時(shí)間。而且，正常骨組織的主要無機(jī)成分就是羥基磷灰石，所以nHA生物相容性好，不會引起免疫排異反應(yīng)，使用更加安全，在骨缺損的治療上，曾經(jīng)有單獨(dú)填充nHA粉末的做法，也有一定的效果。此外，nHA對ALN的吸附能力較強(qiáng)，容易實(shí)現(xiàn)化學(xué)結(jié)合，并且不影響AL的藥理性質(zhì)，兩種材料按照一定比例復(fù)合使用可以改善生物相容性[2]，并對骨組織再生有協(xié)同作用，是一種良好的緩釋體系[3]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用nHA作為載體，與ALN實(shí)現(xiàn)化學(xué)結(jié)合并填充入極限骨缺損，隨著nHA被吸收用于骨缺損修復(fù)的進(jìn)行，ALN得以持續(xù)發(fā)揮作用，與新骨的形成同步緩釋，而不會像其他一些緩釋材料釋放藥物速度與組織需求不協(xié)調(diào)。

大量體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ALN在一定濃度范圍內(nèi)時(shí)，對成骨細(xì)胞功能有促進(jìn)作用，同時(shí)對破骨細(xì)胞活性有抑制作用[4]，因此對于濃度問題，應(yīng)給予嚴(yán)密關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)選取了3個(gè)質(zhì)量比例的nHA-ALN復(fù)合材料，作為骨缺損的修復(fù)材料，在顱骨的缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)中取得了很好的干預(yù)效果。

本實(shí)驗(yàn)顯示，術(shù)后2周，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示了ALN在骨損傷的早期應(yīng)用可能不會影響骨修復(fù)[5]；術(shù)后4周時(shí)，A、C組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.015），其他組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C、D組間差異有明顯趨勢（P=0.107），干預(yù)措施顯現(xiàn)了一定的效果，nHA聯(lián)合ALN使用的干預(yù)效果優(yōu)于nHA單獨(dú)使用； 術(shù)后8周、12周，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是具體數(shù)值上看，C組仍然優(yōu)于其他各組。本實(shí)驗(yàn)只模擬了小囊腫摘除后造成的骨缺損，和不承重部位的坑狀骨缺損。因此，下一步可以考慮將nHA-ALN加工成為骨支架材料，以期更好地解決消耗速度和承重的問題。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Lafisco M， Palazzo B， Falini G， et al. Adsorption and Conformational Change of Myoglobin on Biomimetic Hydroxyapatite Nanocrystals Functionalized with Alendronate[J]. Langmuir， 2008， 24（9）： 4924-4930.

[2] Sugata Y ， Sotome S， Yuasa M， et al. Effects of the systemic administration of alendronate on bone formation in a porous hydroxyapatite/collagen composite and resorption by osteoclasts in a bone defect model in rabbits[J]. J Joint Surg， 2011， 93（4）： 510-516.

[3] Ni M， Li G， Tang PF， Chan KM， Wang Y， et al. rhBMP-2 not alendronate combined with HA-TCP biomaterial and distraction osteogenesis enhance bone formation[J].Arch Orthop Trauma Surg， 2011， 131（11）： 1469-1476.

[4] 李銳，王正艷，施永彥，等.阿侖膦酸鈉對成骨細(xì)胞增殖及礦化的影響[J].醫(yī)學(xué)臨床研究，2010，27（6）：1008-1013.

[5] Mochida Y， Bauer TW， Akisue T， et al. Alendronate does not inhibit early bone apposition to hydroxyapatite-coated total joint implants： a preliminary study[J]. J Bone Joint Surg Am， 2002 ，84-A（2）： 226-235.

（收稿日期：2012-09-03）