反相高效液相色譜法檢測胎盤中的新潔爾滅

[摘要] 目的 應用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測定胎盤中的新潔爾滅。采用甲醇浸泡溶解，10%高氯酸沉淀蛋白的方法，提取樣品后進行高效液相色譜測定。方法 色譜柱：用Acclaim C18色譜柱（250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-水（53：20：27）；紫外檢測器：檢測波長：254 nm；柱溫：30℃；流速：0.85 mL/min。結果 在2.0～10.0μg·mL-1質量濃度范圍內，呈現良好線性關系（r：0.9999），回收率為95.7% ～99.6%，日內RSD為1.4% ～1.8%，日間RSD為1.5%～2.1%。結論 該方法簡便、快速、靈敏、準確，完全符合中國藥典2010版規定，可作為臨床檢測方法。

[關鍵詞] 高效液相色譜法；新潔爾滅；胎盤

[中圖分類號] R96 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2013）01（c）-0015-02

新潔爾滅（Bromogeramine），別名為苯扎溴銨、溴化芐烷銨，常溫下為白色或淡黃色膠狀體或粉末， 低溫時可能逐漸形成蠟狀狀固體，帶有芳香氣味， 但嘗味極苦。易溶于水， 乙醇， 微溶于丙酮， 不溶于乙醚， 苯， 水溶液呈堿性反應。近年來，在一些臨床實踐中該藥被用于引產， 將新潔爾滅注入羊膜腔內，引起胎兒死亡的同時能引起子宮收縮，臨床引產胎兒死亡率可達100%，引產成功率可達95%以上，常為私人醫院或小診所中作為流產藥物用于中期妊娠引產。一直以來，由于對非法鑒定胎兒性別，私自進行藥物流產缺乏科學的檢測方法，難以準確認定，使得由上述人為原因所造成的男女性別比例嚴重失衡現象一直無法得到很好解決。生物樣品中新潔爾滅的準確定性定量方法報道甚少，且難以套用[1-2]，因此本實驗建立反相高效液相色譜紫外法測定生物樣品中新潔爾滅的方法，該方法準確可靠，操作簡單，可考慮作為仲裁分析的常規方法。

1 儀器與試藥

變色龍色譜工作站，UltimateTM3000全自動高效液相色譜儀，過濾裝置（天津華鑫儀器廠）；萬分之一電子分析天平（亞太電子天平廠）；新潔爾滅標準品（中國生物制品檢定所，批號100394-189715，純度99.99%）；庚烷磺酸鈉為HPLC專用。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱：用Acclaim C18色譜柱（250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm）；流動相：甲醇一乙腈一水（53：20：27）；紫外檢測器：檢測波長254 nm；流速：0.85 ml· min-1；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。

2.2 標本的前處理

胎盤標本處理：取胎膜5.0 g，加入甲醇2.0 mL，浸泡溶解1.0 h，渦旋震蕩10 min，以5000 r·min-1速率離心10 min。精密吸取上清液1.0 mL，再加入10%高氯酸0.5 mL，以有機膜0.22 μm過濾，即得胎盤樣品供試液，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖[3]。

2.3 溶液制備

2.3.1 新潔爾滅標準溶液 新潔爾滅貯備液100 μg·mL-1，具體制取方法：精密稱取0.010 0 g新潔爾滅標準品，將其用甲醇溶解定容至100 mL的容量瓶中，即可。

2.3.2 新潔爾滅系列標準溶液 胎盤標準樣：同樣本前處理，將被測樣換成空白樣并在其中加標，配制新潔爾滅的質量濃度分別為1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00，7.00，8.00，9.00及10.00μg·mL-1標準系列樣。

胎盤質控樣：同樣本前處理，將被測樣換成空白樣，并加入對照品，使新潔爾滅的質量濃度分別為2.00 μg·mL-1，5.00μg·mL-1和8.00 μg·mL-1的低、中、高濃度質控樣。

3 實驗結果

3.1 專屬性

如圖1至圖4所示，新潔爾滅與胎盤中的干擾物質呈現完全分離狀態，表明專屬性好。

3.2 線性關系及檢出限

標準系列溶液各取20.0 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以平均峰面積（Y）對濃度（X）作圖，標準系列得一直線，其回歸方程為y=4.65×103X-1.95×102，相關系數r=0.999 7，線性范圍為2.0～10.00 μg·mL-1。胎盤標準系列得一回歸方程為y=3.68×103X-1.05×102，相關系數r=0.9997。線性范圍為2.0～10.0 μg·mL-1的直線。

3.3 回收率與精密度

3.3.1 回收率和日內精密度測試 1 d內重復測定濃度為2.0 μg·mL-1， 5.0 μg·mL-1，8.0 μg·mL-1生物模擬樣各3次，平均回收率分別為95.7%、99.0%和99.6%，RSD% 分別為1.8%、1.5%與1.4%，說明準確度及日內精密度良好。見表1。

3.3.2 日間精密度測試實驗 連續3日重復測定濃度為2.0，5.0，8.0 μg·mL-1的生物模擬樣，平均回收率分別為97.5%、99.3%和99.5%，RSD%分別為2.1%、1.6和1.5%，表明準確度、日間精密度良好。見表2。

3.4 穩定性實驗

為一種季銨鹽陽離子表面活性廣譜殺菌劑活力強，對皮膚和組織無刺激性，對金屬、橡膠制品無腐蝕作用。1：1000溶液廣泛用于手、皮膚、粘膜、器械等的消毒。可長期保存效力不減，故測試和實驗中結果比較穩定[4]。按結果的相對偏差≤5%控制。取2 μg·mL-1新潔爾滅水溶液和胎盤基質樣，分別在放置0 h、3 h、12 h、24 h、2 d、3 d、5 d、7 d后取樣，每個樣品測1次。結果顯示，新潔爾滅的水溶液和胎盤基質液相對偏差均≤5%。

3.5 供試品測定

因死胎或有早產癥狀妊娠3～7個月入孕婦20人作為研究對象，懷疑其為私自非法使用流產藥物墮胎。此20人流產后均將其胎盤標本送檢。分析其樣品結果為2人出現與新潔爾滅保留時間幾乎一致的色譜峰，其濃度分別為（1.8±0.03） μg·mL-1、（2.1±0.05） μg·mL-1。

4 討論

4.1 樣品前處理方法選擇

由于胎盤中脂溶組份較多，擬排除的內源性干擾物主要為水溶性物質，故提取溶劑多選擇有機溶劑。有文獻報道[4]正丁醇一步法提取樣本用的是熒光檢測器，對色譜峰存在干擾，而且正丁醇粘度較大，不易清洗，易造成交叉污染。而該研究采用紫外檢測器，在樣品制備時以甲醇浸泡溶解樣品（甲醇有沉淀析出蛋白的功能），由于胎盤中含有較多胎脂等脂質性物質，如果蛋白析出不完全或其他雜質析出不干凈，會嚴重干擾結果，因而，加入10%的高氯酸進一步沉淀蛋白，可使樣本處理更徹底，提取后的基質液中的雜質濃度明顯地減少，有利于樣本分離檢測。

4.2 流動相選擇

經過多次實驗發現，C18色譜柱測定新潔爾滅門峰拖尾較嚴重。為改善此狀況，通過改變流動相配比多次探索拖尾狀況，后加入庚烷磺酸鈉0.05 mmol·L-1，調PH5.5，實驗前將含水較多的流動相乙腈一水（體積比為35：65）按0.1 mL·mL-1的低流速過柱2～3 h能一定程度上起到改善峰型及拖尾現象[5]。

該實驗經方法學考察和臨床樣本測定結果證實，簡便準確、快速、靈敏、重現性好，為新潔爾滅體液組織藥物濃度檢測標準的建立提供了可靠的依據。

[參考文獻]

[1] Gorser CM， Schier F. Laparoscopic hemiorrhaphy in children[J].Surg Endosc， 2003， 17（4）： 571-573.

[2] Berg C， Ludwig M， Sturm N， et al. Intraamniotic ethacridine lactate instillation versus vaginal PGE1 in second trimester termination of pregnancy[J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol， 2006， 126（2）： 193-196.

[3] Pereira AV， Cass QB. High-performance liquid chromatography method for the simultaneous determination of sulfamethoxazole and trimethoprim in bovine milk using an on-line clean-up column[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci， 2005， 826（1-2）： 139-146.

[4] Fukai R， Sakao Y， Sakuraba M， et al. The prognostic value of carcinoembryonic antigen in T1N1M0 and T2N1M0 non-small cell carcinoma of the lung[J]. Eur J Cardiothorac Surg， 2007， 32（3）： 440-444.

[5] 陳運動.高效液相色譜法測定依沙吖啶注射液含量[J].醫藥導報，2006， 25（6）：572-573.

（收稿日期：2012-07-28）