大劑量沖擊法建立膠質瘤耐替莫唑胺細胞株及生物學鑒定

向定朝，王存祖，陸曉峰，歐陽琦

(1.江蘇大學臨床醫學院，江蘇 鎮江212001;2.蘇北人民醫院神經外科，江蘇 揚州225001;3.江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院，江蘇鎮江212013)

膠質瘤一直是神經外科領域的治療難題，化療是膠質瘤術后重要治療方法之一。目前國際上公認的膠質瘤化療首選藥物是替莫唑胺(temozolomide，TMZ)［1]，但研究顯示替莫唑胺也僅能小幅延長患者生存時間，因膠質瘤耐藥而不能改善其預后。膠質瘤化療耐藥，是膠質瘤化療失敗和膠質瘤復發的原因。近年來“腫瘤干細胞學說”認為，從膠質瘤中分離出來的膠質瘤干細胞(glioma stem cells，GSCs)具有較強的耐藥性，是膠質瘤耐藥以及復發的根本原因。為深入了解膠質瘤對替莫唑胺耐藥的原因，體外構建人腦膠質瘤耐替莫唑胺U251 細胞株(U251/TMZ)，是研究膠質瘤耐藥的基礎。本實驗通過大劑量沖擊法［2]建立膠質瘤耐替莫唑胺細胞模型，并比較U251/TMZ 與親代細胞U251 之間的生物學特征。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及主要試劑

人腦膠質瘤U251 細胞株購于上海生命科學研究所細胞庫;培養細胞貼壁生長的特級胎牛血清、DMEM 低糖培養基、DMSO、胰酶、青鏈雙抗等購于Gibco 公司;CD133、ABCG2 鼠抗人單抗購于Neo-Markers 公司;CD133(AC133)、羊抗鼠IgG(二抗)、CY3等均購于Miltenyi 公司;ECL 化學發光試劑盒購于Merck Millipore 公司;TMZ、噻唑鹽(MTT)等購于Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 用含10%胎牛血清的DMEM 培養基培養U251 細胞，置于CO2培養箱內(37 ℃，5%CO2)培養。當細胞鋪滿培養瓶底壁時進行消化、傳代。

1.2.2 藥物大劑量沖擊法建立U251/TMZ 細胞細胞接種于75 mL 玻璃培養瓶中，貼壁生長至鋪滿瓶底時，參考我們前期實驗及預實驗數據［3]，加入120 μmol/L 的TMZ 進行誘導。常規條件下培養72 h，棄含藥培養液，PBS 洗2 次，加正常培養液，此后1 ～2 天換液1 次，以清除死亡的漂浮細胞。待存活下來的細胞恢復了生長增殖能力并形成較大的細胞克隆(＞100 個細胞)時，胰酶消化，接種至25 mL的玻璃培養瓶中傳代培養，當細胞增殖到足夠數量時，再接種于75 mL 玻璃培養瓶中，按上法再次篩選。培養細胞時間約5 個月，平均每月可篩選1 ～2次。把實驗最后所獲得的細胞作為耐藥細胞，并命名為U251/TMZ。

1.2.3 MTT 法檢測藥物敏感性 取對數期細胞制備細胞懸液，調整細胞數為5 ×104/mL，接種至96孔培養板，每孔200 μL，培養24 h 后加入含不同濃度TMZ 的培養基。TMZ 設6 個試驗濃度，即10，50，100，200，500，1000 μmol/L 和一個空白對照組，每個實驗濃度設置5 個復孔。繼續培養72 h 后，每孔加入0.5% MTT 20 μL，培養箱繼續培養4 h，棄上清，PBS 小心沖洗3 次后，加入DMSO 150 μL，震蕩均勻后酶標儀檢測，設定波長為540 nm 測定每孔的光密度(D)值。采用SPSS 軟件的Probit 程序計算藥物的半數抑制濃度(IC50)，耐藥指數(resistance index，RI)=耐藥細胞IC50/親本細胞IC50。

1.2.4 細胞生長增殖曲線繪制 取生長狀態良好的細胞，將U251/TMZ 和親代細胞懸液(1 ×104個/mL)分別接種至6 孔板中，不同細胞設3 個復孔，每孔接種1 mL，分別于接種后每間隔24 h 計數1 次，連續觀察1 周。每次計數取3 個復孔細胞數的平均值，以培養時間為橫坐標，細胞數為縱坐標繪制生長曲線。

1.2.5 免疫熒光檢測CD133 表達 細胞接種于24孔培養板中，細胞貼壁生長好后(約12 h)，用4%低聚甲醛固定，3% BSA 4 ℃封閉30 min，加入CD133一抗，放入4 ℃冰箱過夜。第2 天用PBS 漂洗3 次后，加入帶CY3熒光標記的二抗，37 ℃水浴箱溫熱2 h，經Hoechst 33342 復染后，PBS 漂洗3 次，置熒光顯微鏡下觀察并攝片。

陽性細胞判斷:CD133 陽性為細胞膜出現紅色熒光，Hoechst 33342 復染后，陽性細胞為細胞核出現藍色熒光。結果分析:置于高倍鏡下觀察，每孔隨機取3 個不同視野拍照，采用ImageJ 軟件計算細胞數，并計算陽性細胞率。陽性細胞率=CD133 陽性細胞數/Hoechst 33342 陽性細胞數。

1.2.6 蛋白質印跡法檢測ABCG2 蛋白的表達 取對數生長期的U251/TMZ 和親代細胞，調整細胞數為1 ×106個/mL，分別接種于6 孔板中。細胞培養24 h 后，收集細胞并提取總蛋白。用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，按12 μg 上樣加入凝膠孔中，開始SDS-PAGE 凝膠電泳。電泳結束后，使用半干膜法轉印到PVDF 膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入ABCG2 一抗4 ℃孵育過夜后，洗滌3 次，每次10 min，二抗室溫孵育2 h 洗滌3 次，每次10 min，使用ECL 化學發光試劑盒顯影，通過CCD 凝膠成像系統采集圖像，采用Lane1D 軟件分析條帶灰度。

1.3 統計學分析

應用統計軟件SPSS 16.0 進行統計學處理，計量資料以均數±標準差(±s)表示，成組資料比較采用兩樣本t檢驗;以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 成功構建U251/TMZ 細胞株

在早期加入TMZ 后，大量U251 細胞死亡。經過約3 個周期培養后，細胞耐藥性產生，再次加入TMZ后細胞死亡數目逐漸減少。約經過5 個月的培養，獲得相對穩定的膠質瘤耐藥細胞株U251/TMZ。顯微鏡下觀察，親代膠質瘤細胞多為梭形，大小均勻，邊界清楚，貼壁生長。耐藥細胞株大部分貼壁形態相似，異形性不顯著，有少部分細胞變形，并有巨細胞產生。和親代細胞株相比，細胞輪廓更清晰。見圖1。

圖1 耐藥膠質瘤細胞株的形態變化(×100)Fig 1 Morphological changes of temozolomide resistant glioma cell line

2.2 U251/TMZ 對替莫唑胺的敏感性變化

使用不同濃度梯度的TMZ 作用于U251/TMZ 和親代細胞，采用SPSS 的Probit 程序計算IC50，結果親代細胞的IC50為(35.62 ±2.97)μmol/L，U251/TMZ的IC50為(286.76 ±8.36)μmol/L，U251/TMZ 是親代細胞的8.1 倍，差異具有統計學意義(t=-63.28，P=0.00)。

2.3 細胞增殖倍增的改變

U251/TMZ 和親代細胞以相同數量接種后，于第3 天可以觀察到兩種細胞生長速度明顯不一樣，親代細胞第3 天進入對數生長期，而U251/TMZ 生長緩慢，第4 天進入對數生長期，且生長曲線的斜率也減小，表明耐藥細胞較親代細胞增殖減慢，倍增時間增加。見圖2。

圖2 U251/TMZ 與親代U251 細胞增殖曲線Fig 2 Proliferation curve of U251/TMZ and U251 cell

2.4 U251/TMZ 細胞CD133 的表達

免疫熒光檢測結果顯示，親代細胞中CD133 陽性率為(3.9 ±0.99)%，U251/TMZ 中CD133 陽性率為(65.3 ±4.16)%，差異具有統計學意義(t=45.35，P=0.00)。

2.5 U251/TMZ 細胞ABCG2 蛋白的表達

蛋白質印跡結果見圖3，定量分析顯示U251/TMZ 細胞ABCG2 蛋白的相對表達量為(71.3 ±25.8)，明顯高于親代細胞的(0.11 ±0.3)，差異具有統計學意義(t=6.19，P＜0.00)。

圖3 U251 及U251/TMZ 細胞ABCG2 的表達Fig 3 ABCG2 expression of U251 and U251/TMZ cell

3 討論

3.1 膠質瘤耐藥細胞的培養

在體外建立耐藥細胞株的常用方法為藥物濃度連續遞增法和大劑量沖擊法［4]。這兩種方法建立的細胞模型在生物學特性及形態結構方面有很大差別。濃度梯度遞增法建立的細胞模型是通過化療藥物逐漸緩慢增加濃度而誘導細胞發生獲得性耐藥，這種方法獲得的耐藥性很高，細胞的形態及亞細胞結構常常發生很大的變化。大劑量沖擊法是通過化療藥物大劑量、短時間內作用于細胞，從而篩選出本身就具有較強耐藥性的細胞。大劑量沖擊法的給藥過程與臨床化療過程中的給藥方法非常接近。目前認為通過大劑量沖擊法建立膠質瘤耐藥細胞模型，比較符合臨床耐藥實際［5]。為了減少臨床化療的不良反應，提高療效，臨床上常常大劑量短程給藥，使藥物濃度迅速地達到較高的血峰濃度，持續數天后停藥，間隔一段時間后再行第2 次化療。該模型與臨床化療耐藥產生的過程相似，有助于研究臨床耐藥的原因。本研究采用大劑量沖擊法成功建立膠質瘤耐藥細胞株，其生物學特征有明顯的改變，細胞生長速度減慢，增殖倍增時間延長。

3.2 U251/TMZ 耐藥性的改變

多藥耐藥是惡性腫瘤的一種特殊生物學特征，是指惡性腫瘤細胞接觸一種抗癌藥后，繼而對多種結構不同、作用機制各異的其他抗癌藥產生耐藥性。ABCG2 轉運蛋白是一種與腫瘤多藥耐藥有關的新的藥物排出泵，具有維持干細胞穩定性、維持組織細胞的穩態等生理功能，在低氧環境中ABCG2 的上調可增加腫瘤細胞對化療藥物的抗藥性。ABCG2 通過結合和水解ATP 并利用能量，能轉運多種化療藥物，把具有不同化學結構和作用于細胞內不同位置靶點的化療藥物泵出胞外，從而使腫瘤對多種抗癌藥物產生抗藥性，其表達特性與惡性腫瘤化療效果有密切關系，高表達者化療效果不佳，而低表達則療效較好。本研究結果表明，U251/TMZ 細胞ABCG2的表達比親代細胞顯著增加，說明其耐藥性顯著性增加。U251/TMZ 的這種獲得性耐藥使得膠質瘤的治療具有多變性、復雜性。

3.3 膠質瘤耐藥細胞與干細胞存在相關性

GSCs 是維持膠質瘤發生、發展以及復發的關鍵因素［6]，腫瘤干細胞是膠質瘤細胞耐藥的主體細胞。而以往的觀點認為，膠質瘤耐藥細胞是導致膠質瘤復發的根源。那么能否認為GSCs 與膠質瘤耐藥細胞就是同一類細胞呢?在本實驗中，我們應用免疫熒光法檢測了U251/TMZ 細胞CD133 表達情況，結果U251/TMZ 細胞CD133 陽性率顯著高于親代細胞，即有較多耐藥細胞表達干細胞的特征，而不是所有的耐藥細胞都表達干細胞特征。為此，我們認為膠質瘤耐藥細胞與GSCs 之間存在一定相關性，兩者并不是同一類細胞。這也預示了腫瘤化療的復雜性，膠質瘤化療耐藥呈現為十分復雜的生物學過程，具有多機制、多因素的特點［7-8]。膠質瘤的先天性耐藥和這種獲得性化療耐藥是導致化療復雜的根本原因。

綜上所述，通過大劑量沖擊法構建的耐藥細胞株具有耐藥性，所獲得的耐藥細胞株中有大量的細胞具有膠質瘤干細胞特性，提示膠質瘤化療具有復雜多變性。

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［7]宗志濤，黃燕，于軍. 膠質瘤耐藥機制研究進展［J]. 山東醫藥，2011，51(2):111-112

［8]孫國臣，許百男，馬曉東. 腦膠質瘤化療耐藥機制的研究進展［J]. 臨床軍醫雜志，2011，39(2):392-394.