結核感染T細胞斑點試驗在結核病診斷中的應用價值

王立紅 付秀華 張桂芝 李國華 顧巖 高俊珍

據WHO估計, 2011年全球約有870萬例新發結核病患者,140萬例死于結核病[1]。結核病已成為全球所有傳染性疾病中成年人的首要死因。2004年WHO報告顯示，結核病診斷率僅為37%, 即使在發達國家也僅有50%的結核病患者通過細菌學方法被證實[2]。因此，尋求一個敏感度及特異度均較高的檢測方法已成為臨床的迫切需求。大量研究表明，結核特異抗原誘導活化分泌γ干擾素的T 淋巴細胞可作為結核分枝桿菌感染的一種可靠標志物。酶聯免疫斑點法(enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT)(T-SPOT.TB)被認為是目前檢測T淋巴細胞反應最靈敏的方法，而且可以應用于疫苗的研發、臨床診斷以及基礎研究等多個方面[3]。目前，國內外多數研究缺乏大樣本的統計數據，我院自2011年7月至2012年4月應用此項技術共檢測1042例患者，本研究總結分析了其中有較完整資料的587例住院患者的檢測結果,以評價T-SPOT.TB技術在結核病診斷及鑒別結核是否活動方面的應用價值。

對象和方法

一、研究對象和試劑來源

1.研究對象：收集2011年7月至2012年4月我院行T-SPOT.TB檢測的587例住院患者，患者來源于風濕科、呼吸科、消化科、胸外科及內分泌等多個科室，男232例，女355例，年齡13～88歲，平均年齡(53.30±16.11)歲。按照患者各自最后確診情況，分為結核性疾病組(亞組分為活動性結核與陳舊性結核；肺結核與肺外結核)和非結核性疾病組(亞組分為免疫損害組和非免疫損害組)，收集患者的年齡、性別、病程、臨床表現、T-SPOT.TB、病理、PPD、抗酸桿菌涂片及結核抗體(Mtb-Ab)等結果。

結核性疾病組128例，其中活動性結核組103例的具體情況見表1，陳舊性結核組25例(肺結核18例，結核性胸膜炎6例，腎結核1例)；非結核性疾病組459例，其中免疫損害者[4]241例，非免疫損害者218例。

活動性結核性胸膜炎診斷標準：①有低熱、盜汗、乏力等結核中毒癥狀；②超聲檢查提示有胸腔積液，肺部CT檢查提示伴或不伴結核病灶；③胸腔積液化驗為以單核細胞為主的滲出液，用酶法檢測腺苷脫氨酶(ADA)>45 U/L；④胸腔積液查癌細胞為陰性，癌胚抗原正常；⑤抗結核治療胸腔積液吸收明顯；⑥胸膜活檢有典型結核病變(如結核性肉芽腫或干酪樣病變)，或痰抗酸桿菌涂片陽性；符合①～⑤或⑥，并且抗結核治療至少2周，活動性結核性腹膜炎及心包炎的診斷標準與之相同。

活動性肺結核患者的診斷均符合文獻[4]的標準。陳舊性結核是指影像學發現患者肺上出現的典型硬結、纖維化和鈣化，而患者自身無結核中毒癥狀，無病理學、細菌學陽性結果，亦無PPD強陽性結果及血紅細胞沉降率增快等結核病活動證據。在隨后的胸部X線復查時，患者肺部的病變不出現任何變化。或患者曾經患過結核，經過治療完全痊愈或未經治療自行痊愈者。

2.儀器和試劑：HealForce培養箱，T-SPOT.TB試劑盒(Oxford Immunotec Ltd， 英國)；酶聯免疫熒光斑點分析儀(AID公司，德國)；Thermo Scien-tific Sorvall ST 40系列離心機、淋巴細胞分離液、Gibco AIM-V、Gibco RPMI 1640細胞培養液(上海復星長征醫學科學有限公司)。

二、方法

1.分離血外周淋巴細胞：用肝素抗凝管采集患者剛入院時未開始治療前清晨空腹外周血4 ml,常規分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)，用細胞培養基AIM-V將細胞懸起，計數后細胞懸液濃度調至1.0×106個/ml。

表1 103例活動性結核病患者資料

2.制備胸腔、腹腔、心包積液及腦脊液單個核細胞：50 ml無菌注射器留取患者剛入院未開始治療前新鮮非血性胸腔、腹腔或心包積液50 ml,1250 U肝素抗凝。高壓滅菌離心管采集該標本10 ml, 20 ℃、1800 r/min, 離心7 min，離心半徑17.4 cm；棄上清,將管底細胞懸起,培養基洗滌,加培養基3 ml，作稀釋，緩慢加入內有3.5 ml淋巴分離液中，使稀釋血液重疊于分離液上。20 ℃、2300 r/min，離心22 min(離心半徑16.9 cm), 取出懸浮于血漿和分離液間的PBMCs，用培養基洗滌2次，20 ℃、1800 r/min，離心7 min (離心半徑17.4 cm)。用細胞培養基AIM-V將細胞懸起, 計數后調整細胞懸液濃度至1.0×106個/ml。

3.ELISPOT檢測：在已包被γ干擾素單克隆抗體的96孔板上，分別加入50 μl細胞培養基作為空白對照，50 μl植物血凝素作為陽性對照，50 μl結核分枝桿菌特異性混合多肽ESAT-6和CFP-10作為刺激源。然后每個孔中加入100 μl上述細胞懸液，每個標本點4個孔。把96孔板放在37 ℃培養箱培養16～20 h后，用pH值7.4的PBS洗液洗板4次，每次200 μl。然后加入堿性磷酸酶標記的二抗，再4 ℃孵育1.5 h。孵育后用pH值7.4的PBS洗液洗板4次，每次200 μl，最后每孔加入50 μl顯色底物液，室溫避光靜置5 min,去離子水終止反應。

4.結果判定：(1)實驗有效的判定：空白對照內斑點形成細胞(spot forming cell, SFC)計數<10個，且陽性對照孔內SFC計數>20個。(2)陽性結果的判定：a.檢測孔SFC-陰性孔SFC計數≥6個；b.空白對照孔內SFC計數≥6個, 檢測孔必須>2倍空白對照孔的SFC計數。(3)最終SFC計數判讀：檢測孔內SFC計數-陰性對照孔內的SFC計數×4，結果記作：SFC/106，其中一項陽性結果則結果判定為陽性，陽性閾值是結果≥24個SFCs/106。試驗全程由我院風濕免疫科化驗室經過專業化培訓的實驗員操作。

5.統計學方法：檢測結果用SPSS 16.0 軟件處理，計量資料為非正態分布，采用中位數和上下四分位數表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗，計數資料采用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.結核性疾病患者T-SPOT.TB檢測結果：活動性結核與陳舊性結核病患者混合肽ESAT-6和CFP-10總SFC中位數分別為502個/106PBMCs和430個/106PBMCs, 四分位數間距(P25, P75)分別為(217個/106PBMCs,1287個/106PBMCs)和(140個/106PBMCs,1303個/106PBMCs)，兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗，差異無統計學意義(U=429.5，P=0.585)。肺結核與肺外結核患者混合肽ESAT-6和CFP-10總SFC中位數分別為456個/106PBMCs和528個/106PBMCs, 四分位數間距(P25, P75)分別為(264個/106PBMCs,950個/106PBMCs)和(186個/106PBMCs,1244個/106PBMCs)，兩組間差異無統計學意義(U=1083.0，P=0.871)。

2.本組患者T-SPOT.TB檢測結果及與其他檢測方法的比較：本組587例患者中T-SPOT.TB陽性者187例,其中確診結核病患者106例，陽性預測值56.68%(106/187)；400例陰性者中確診非結核病患者378例，陰性預測值 94.50%(378/400)(表2)。T-SPOT.TB檢測結果與患者的性別、年齡、病程無關。PPD、抗酸桿菌涂片、Mtb-Ab診斷結核病的特異度分別為91.87%(192/209)、100.00%(302/302)、93.42%(71/76)，均高于T-SPOT.TB的特異度[82.35%(378/459)]，組間比較采用χ2檢驗， T-SPOT.TB與PPD比較(χ2=10.382,P=0.01)、T-SPOT.TB與抗酸桿菌涂片比較(χ2=33.842,P=0.00)、T-SPOT.TB與Mtb-Ab比較(χ2=5.921,P=0.08),差異均有統計學意義，其余比較結果見表3。

討 論

近年來, T-SPOT.TB 試驗技術在結核分枝桿菌感染診斷方面被證明具有較高的敏感度和特異度, 且此項技術于2006年通過了英國國家臨床最優化研究所(National Institute of Clinical Excellence,NICE)認證,相關報道日益增多[2,5]。一項薈萃了3個研究的Mata分析[6]中，2個是分別在南韓和日本普通流行區的研究，T-SPOT.TB的特異度分別為84.73% (111/131)、83.33%(70/84)；1個是在德國低流行區的研究，T-SPOT.TB的特異度為97.50% (39/40)。本研究非結核性疾病患者中免疫損害者與非免疫損害者T-SPOT.TB的特異度分別為71.37% (172/241)、94.50%(206/218)。這些研究結果提示在低危人群檢測T-SPOT.TB的特異度高，而檢測有潛在Mtb感染的高危人群時，T-SPOT.TB的特異度明顯降低。

本研究中，陽性預測值56.68%(106/187)，陰性預測值 94.50%(378/400)，活動性結核病的檢測敏感度為93.20%(96/103)，與Kang等[7]報道的結果相似，陳舊性結核病的檢測敏感度為40.00% (10/25)，活動性結核病與陳舊性結核病患者的SFC計數的中位數分別為502個/106PBMCs、430個/106PBMCs，兩者比較差異無統計學意義(U=429.5,P=0.585)，肺內結核與肺外結核之間的SFC計數比較，差異亦無統計學意義(U=1083.0，P=0.871)。提示該試劑盒在結核病的檢出方面具有較高的敏感度，是篩查結核病的敏感指標，但不能鑒別結核病是活動性、陳舊性或潛伏性感染，與國外一些報道相似[8]，而T-SPOT.TB陰性排除結核病的意義更大。

本研究中，免疫損害者的假陽性率高達28.63%(69/241)，明顯高于非免疫損害者的假陽性率(5.50%，12/218),說明免疫抑制狀態患者T-SPOT.TB陽性率較高，免疫抑制狀態并不影響T-SPOT.TB的敏感度，支持Kim等[9]的觀點，這些患者可能有發生活動性結核病的潛在風險，需密切隨訪。

本研究中T-SPOT.TB檢測診斷結核性疾病敏感度為82.81%(106/128),均高于PPD [35.71%(30/84)]、抗酸桿菌涂片[8.74%(9/103)]及Mtb-Ab[14.06%(9/64)]的敏感度。而T-SPOT.TB檢測的特異度為82.35%(378/459),均不及PPD[91.87%(192/209)]、抗酸桿菌涂片[100.00%(302/302)]、Mtb-Ab [93.42%(71/76)]的特異度,差異有統計學意義(P<0.05)。表明T-SPOT.TB檢測與現有的一些結核診斷手段相比，具有明顯的優勢，但特異度相對較低，診斷需結合臨床。

表2 各組患者T-SPOT.TB檢測結果

注a：特異度；b：假陽性率

表3 T-SPOT.TB檢測與其他結核診斷方法檢測結果的比較

注由于是回顧性分析，部分患者未行PPD、抗酸桿菌涂片和Mtb-Ab檢查

本研究中結核性胸膜炎26例，結核性腹膜炎11例， T-SPOT.TB的敏感度為100.00%(37/37)；結核性心包炎2例，陽性者1例，因例數較少需進一步研究。表明T-SPOT.TB試驗用來診斷活動性結核性胸膜炎及腹膜炎的敏感度很高，當胸、腹腔積液中無結核分枝桿菌特異性細胞幾乎可以排除活動性胸膜結核，但因有一定的假陽性率，故陽性結果需要綜合其他的臨床表現及相關檢查明確診斷。

總之，T-SPOT.TB 在結核病診斷方面具有較高的敏感度[10]，尤其是漿膜腔積液及活動性結核病[11]，受機體的免疫狀態影響較小，不受卡介苗接種的影響，在活動性肺結核、肺外結核、潛伏性結核感染及免疫抑制的結核病患者均能檢測，診斷快速，24 h出結果，能早期診斷結核分枝桿菌感染。同時，當結核分枝桿菌被清除后，效應T細胞即消失，故檢測效應T淋巴細胞可進行臨床療效評估。由于效應T細胞有向胸膜腔聚集的特點，故檢測胸腔積液中的單個核細胞能更加靈敏、準確地反應結核分枝桿菌感染的狀態，與外周血T-SPOT.TB聯合應用，能更有效、準確地診斷結核性胸膜炎。T-SPOT.TB試驗也存在一些不足，其檢測步驟繁瑣,價格昂貴,對實驗室和技術要求較高，限制了其在基層醫院的開展；另外，尚缺少大量、客觀的臨床試驗數據。此外,結核分枝桿菌感染后的免疫反應與結核病的發生、發展及轉歸的關系尚未完全明了，所以T-SPOT.TB檢測尚不能完全鑒別結核病是否為活動性、陳舊性或潛伏性。

[1] Glaziou P, Falzon D, Floyd K,et al. Global epidemiology of tuberculosis. Semin Respir Crit Care Med，2013,34(1):3-16.

[2] 樂軍,梁莉,李蘇輝, 等. 酶聯免疫斑點試驗快速診斷結核分枝桿菌感染的臨床應用價值.中華檢驗醫學雜志, 2006, 29(11): 1005-1008.

[3] Lalvani A．Diagnosing tuberculosis infection in the 21st century: new tools to tackle an old enemy.Chest,2007,131(6):1898-1906.

[4] 中華醫學會結核病學分會.肺結核診斷和治療指南.中華結核和呼吸雜志,2001,24(2):70-74.

[5] Meier T, Eulenbruch HP, Wrighton-Smith P, et al. Sensitivity of a new commercial enzyme-linked immunospot assay (T SPOT-TB) for diagnosis of tuberculosis in clinical practice.Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2005, 24(8):529-536.

[6] Diel R, Loddenkemper R, Nienhaus A.Evidence-based comparison of commercial interferon-gamma release assays for detecting active TB: a metaanalysis. Chest, 2010,137(4):952-968.

[7] Kang YA, Lee HW, Hwang SS, et al. Usefulness of whole-blood interferon-gamma assay and interferon-gamma enzyme-linked immunospot assay in the diagnosis of active pulmonary tuberculosis. Chest,2007,132(3): 959-965.

[8] Ariga H，Harada N．Evolution of IGRA researches.Kekkaku，2008，83(9)：641-652.

[9] Kim SH，Song KH，Choi SJ，et al．Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients. J Med，2009，122(2): 189-195.

[10] 曾誼，馮梟，宋梅梅，等. 酶聯免疫斑點試驗在菌陰肺結核診斷中的價值. 中國防癆雜志，2012,34(2):100-102.

[11] 趙靜,蔣彩花，汪運山，等. 抗結核抗體及結核感染T細胞斑點試驗在結核病診斷中的應用.中國防癆雜志，2009，31(1):19-21.