肺結核患者全血γ干擾素釋放試驗影響因素的探討

楊新婷 楊揚 杜鳳嬌 卜建玲 梁清濤 李琦 陳效友

機體在感染結核分枝桿菌后，體內存在特異的效應T淋巴細胞，致敏的T淋巴細胞在體外再次受到結核分枝桿菌特異抗原的刺激時，會分泌并釋放IFN-γ，這就是γ-干擾素釋放試驗(interferon-gamma release assay，IGRAs)所依據的基本原理。其所選用的結核分枝桿菌特異抗原是來自于RD1區的2個早期分泌蛋白：早期分泌抗原靶-6(early secretory antigenic target, ESAT-6)與培養濾過蛋白-10(culture filtrate protein，CFP-10)；因其僅存在于結核分枝桿菌復合群，在所有的卡介苗和絕大多數非結核分枝桿菌中缺乏，因此可保證其較高的特異性。此外，ESAT-6和 CFP-10還是重要的T細胞抗原，能誘導機體產生記憶性免疫應答[1-2]。

目前已經有2個商業化的IGRAs的試劑盒分別通過美國和歐洲FDA的批準得以在臨床上用于診斷結核潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)和輔助診斷活動性肺結核(active tuberculosis，ATB)。第一種是酶聯免疫斑點實驗(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)，其商品化的試劑盒為T-SPOT.TB(T-SPOT)試劑盒，試驗需要分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，然后與RD1區抗原共同孵育，使用酶聯免疫斑點的方法檢查分泌干擾素的特意效應T淋巴細胞；第二種是方法是全血γ干擾素釋放試驗，其商品化試劑盒為QuantiFERON-TB GOLD(QFT-G)和QuantiFERON-TB GOLD In Tube(QFT-GIT)，其主要優勢為不用分離PBMC，直接將肝素化的全血與RD1區抗原共同孵育，使用ELISA的方法檢測彌散至血漿中IFN-γ的水平來達到診斷的目的。由于采集的血漿可以保存，再加上操作簡便、技術簡單，在免疫功能正常的人群中有著和ELISPOT一樣好的敏感度和特異度，這就使得全血γ干擾素釋放試驗更加適用于我國經濟基礎薄弱的國情和大規模流行病學調查的研究。全血γ干擾素釋放試驗作為體外細胞免疫的診斷試驗，近年來用于臨床活動性肺結核的輔助診斷，在復雜的臨床工作中，結核病患者的不同狀態、菌量負荷、淋巴細胞數量、疾病嚴重程度均有可能影響細胞免疫狀態從而影響實驗結果，本研究擬就3種抗原刺激下的全血干擾素釋放試驗在肺結核患者中的影響因素進行初步探討。

資料和方法

一、一般資料

選取2010年6月至2012年6月期間首都醫科大學附屬北京胸科醫院住院肺結核患者、新職工和健康體檢的學生志愿者共計141例(名)，男86例(名)，女55例(名)，所有受檢者均為HIV陰性，無妊娠，無應用免疫抑制劑和免疫增強劑史，抗結核治療<1周。

二、選例標準

菌陽肺結核組：痰集菌連續至少2次(+)或痰結核分枝桿菌培養陽性至少1次；共計44例，年齡(46.6±18.4)(17～90)歲。菌陰肺結核組：至少3次痰集菌及1次痰結核分枝桿菌培養陰性，具有典型活動性肺結核臨床癥狀和影像學表現，排除其他非結核肺部疾病，經抗結核治療病變吸收良好病情好轉的患者；共計47例，年齡(38.3±16.8)(16～76)歲。陳舊性肺結核組：有或無明顯的結核病史，無結核病的臨床癥狀和體征，胸部X線或CT發現硬結、條索、鈣化病灶；共計15例，年齡(57.4±12.6)(20～76)歲。健康對照組：為新職工和健康體檢的學生，無明顯的結核病接觸史、無臨床癥狀和體征、X線胸片檢查無異常表現、無其他疾病的健康人群；共計35名，年齡(21.8±2.11)(18～27)歲。為探討肺結核患者胸部CT病變廣泛程度對實驗結果的影響，根據結核病患者(包括菌陽及菌陰肺結核組和陳舊性肺結核組)影像學特點，將每一個肺段計為1分，病變累及超過1/2肺段的計為1分，不足1/2肺段的計為0.5分，累計得出每一位肺結核患者的CT評分，按是否≥4分將患者分為肺部病變累及少組(0～3.9分)和肺部病變累及多組(4～15分)。

該項研究經首都醫科大學附屬北京胸科醫院倫理委員會審核并通過，征得受試對象同意并簽署知情同意書。

三、試驗方法

標本收集和檢測：結核病組患者于入院次日清晨抽取空腹靜脈血5 ml，置于真空肝素抗凝管中；健康對照組統一采血，清晨抽取空腹靜脈血5 ml，置于真空肝素抗凝管中。采血后6 h內將靜脈血1 ml加入24孔培養板內共5孔，每孔依次加入聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates, PHA)(陽性對照)、PPD、ESAT-6、 ESAT-6/CFP-10和生理鹽水(陰性對照)并于5%CO2、37 ℃細胞培養箱孵育過夜約16～22 h，次日收集血漿至少300 μl，于-20 ℃保存；收集的血漿采用美國BD公司生產的IFN-γ檢測試劑盒，嚴格按照試劑盒要求進行操作。抗原的終濃度分別為PHA(20 μg/ml)、PPD(20 μg/ml)、ESAT-6(40 μg/ml)、 ESAT-6/CFP-10(20 μg/ml)，最后1孔加入等體積生理鹽水。

四、統計學方法

結 果

一、各抗原刺激后健康對照組和活動性結核病患者組血漿中IFN-γ的含量

分別以抗原ESAT-6、 ESAT-6/CFP-10融合抗原和抗原PPD刺激，檢測刺激后血漿中IFN-γ含量，活動性肺結核患者組顯著高于健康對照組，兩者差異有統計學意義(P<0.01)(表1)。

二、不同影響因素下抗原刺激后IFN-γ含量

(一)菌陽和菌陰肺結核患者組的比較

比較3種抗原(ESAT-6、ESAT-6/CFP-10和PPD)刺激后菌陽肺結核組和菌陰肺結核組間血漿IFN-γ含量，結果顯示，菌陽肺結核組與菌陰肺結核組之間IFN-γ含量差異無統計學意義(P>0.05)(表2)。

(二)陳舊性肺結核組、菌陽肺結核組和菌陰肺結核組的比較

在3種抗原刺激后，比較陳舊性肺結核組、菌陰肺結核組和菌陽肺結核組間血漿IFN-γ含量后發現，各抗原表現復雜，ESAT-6和ESAT-6/CFP-10抗原刺激后分泌IFN-γ的量在菌陰肺結核組和陳舊性肺結核組之間差異無統計學意義(P>0.05)；ESAT-6抗原刺激后分泌IFN-γ的量在菌陽肺結核組和陳舊性肺結核組之間差異無統計學意義(P>0.05)，但ESAT-6/CFP-10抗原刺激后分泌IFN-γ的量在菌陽肺結核組和陳舊性肺結核組之間差異有統計學意義(P<0.05)，PPD在菌陰肺結核組和陳舊性肺結核組、菌陽肺結核組和陳舊性肺結核組之間差異均有統計學意義(P<0.05)(表3，4)。

表1 各抗原刺激后健康對照組和活動性肺結核患者組血漿中IFN-γ的含量

注本試驗中部分數據呈偏態分布，因此用中位數(M)表示，括號內為IFN-γ含量的最小值和最大值；E、E/C、D分別表示以ESAT-6、ESAT-6/CFP-10融合抗原和PPD為抗原刺激后血漿中IFN-γ的含量

表2 各抗原刺激后菌陽和菌陰肺結核患者組血漿中IFN-γ的含量

注本試驗中部分數據呈偏態分布，因此用中位數(M)表示，括號內為IFN-γ含量的最小值～最大值；E、E/C、D分別表示以ESAT-6、ESAT-6/CFP-10融合抗原、PPD為抗原刺激后血漿中IFN-γ的含量

(三)不同評分結果的肺結核患者IFN-γ含量

3種抗原刺激后發現，病變面積大(4～15分)的患者ESAT-6和ESAT-6/CFP-10刺激后血漿IFN-γ含量低于病變面積小的患者，差異有統計學意義(P<0.05)；而PPD刺激后血漿IFN-γ含量在兩組之間接近，差異無統計學意義(P>0.05)(表5)。

(四)不同的外周血淋巴細胞計數結果患者的IFN-γ含量

外周血淋巴細胞計數分為<1.0×109/L組和≥1.0×109/L組，3種抗原刺激后結果顯示，血漿IFN-γ含量在<1.0×109/L組顯著低于≥1.0×109/L組，差異有統計學意義(P<0.05)(表6)。

表3 各抗原刺激后菌陽肺結核組與陳舊性肺結核組患者血漿中IFN-γ的含量

注本試驗中部分數據呈偏態分布，因此用中位數(M)表示，括號內為IFN-γ含量的最小值～最大值；E、E/C、D分別表示以ESAT-6、ESAT-6/CFP-10融合抗原、PPD為抗原刺激后血漿中IFN-γ的含量

表4 各抗原刺激后菌陰肺結核組與陳舊性肺結核組患者血漿中IFN-γ的含量

注本試驗中部分數據呈偏態分布，因此用中位數(M)表示，括號內為IFN-γ含量的最小值和最大值；E、E/C、D分別表示以ESAT-6、ESAT-6/CFP-10融合抗原、PPD為抗原刺激后血漿中IFN-γ的含量

表5 各抗原刺激后不同病變范圍的肺結核患者血漿中IFN-γ的含量

注本試驗中部分數據呈偏態分布，因此用中位數(M)表示，括號內為IFN-γ含量的最小值～最大值；E、E/C、D分別表示以ESAT-6、ESAT-6/CFP-10融合抗原、PPD為抗原刺激后血漿中IFN-γ的含量

表6 各抗原刺激后不同的淋巴細胞計數的結核病患者血漿中IFN-γ的含量

注本試驗中部分數據呈偏態分布，因此用中位數(M)表示，括號內為IFN-γ含量的最小值～最大值；E、E/C、D分別表示以ESAT-6、ESAT-6/CFP-10融合抗原、PPD為抗原刺激后血漿中IFN-γ的含量

討 論

全血γ干擾素釋放試驗作為新的體外細胞免疫檢測的手段，因其不受卡介苗接種后的交叉反應，以及不受絕大多數非結核分枝桿菌的影響，主要用于LTBI的診斷[3]，其敏感度和特異度可以高達90%以上[4-6]；盡管IGRAs目前尚不能很好地鑒別LTBI和ATB，但因其在ATB中很好的陽性檢出率[7-8]，近年來被廣泛用于ATB的輔助診斷。在活動性肺結核中，ELISPOT的總敏感度波動于77%～79%之間[9]，QFT-IT波動于55%～58%之間[10-11],在探討其敏感度降低的原因上，多數學者推測可能為ATB患者臨床復雜多樣，菌量負荷、病變廣泛程度、疾病嚴重程度、年齡、基礎疾病、營養狀態等均可導致其細胞免疫功能低下從而影響實驗結果，本研究擬在結核分枝桿菌負荷、病變的活動性、影像學和外周血淋巴細胞計數4個方面來探討這些因素對全血干擾素釋放試驗的影響。

痰菌陽性常提示體內結核分枝桿菌菌量負荷較重，機體結核分枝桿菌應該處于活躍復制的階段，結核分枝桿菌分泌性蛋白如ESAT-6和CFP-10的分泌量就會較高；同樣菌陽的患者往往病情較重，細胞免疫功能降低。在本研究中，兩組之間IFN-γ的分泌量差異無統計學意義，提示本研究中的3種抗原刺激所引起的IFN-γ的分泌量不受是否排菌的影響，因此該試驗對菌陰肺結核的診斷有著重要的意義。相似的結論可見于其他的研究報告[12]。

陳舊性肺結核是指無臨床癥狀、影像學表現為硬結條索鈣化且痰菌陰性的人群。我國屬于結核病高流行地區，人群感染結核分枝桿菌比率普遍較高，部分人群自身免疫和營養功能良好而獲得自愈。在筆者探討該方法能否區別陳舊性肺結核和菌陽肺結核和菌陰肺結核中，3種抗原呈現不一致的表現，分析其主要原因可能與陳舊性肺結核組樣本量過少有關。此外，結核分枝桿菌潛伏感染、活動性結核病、陳舊性肺結核只是機體感染結核分枝桿菌的不同階段，反映了機體免疫系統在對抗結核分枝桿菌進入機體后的一系列過程，其三者之間的界限很難界定。無論哪個階段，機體都曾經感染過結核分枝桿菌，體內均存在結核分枝桿菌特異的記憶T淋巴細胞，因此在體外再次受到結核分枝桿菌特異抗原的刺激時，均會釋放分泌IFN-γ。同樣復雜矛盾的結果在對ATB和LTBI的比較中也能看到，即基于ESAT-6和CFP-10抗原的干擾素釋放試驗并不能區分活動性結核病和結核分枝桿菌潛伏感染[13]。另一個主要原因可能是我國為結核病高感染率國家，部分人群高暴露于結核分枝桿菌環境中，在部分陳舊性肺結核患者中，盡管機體已經清除了結核分枝桿菌的感染，但是由于持續暴露于結核分枝桿菌的環境之中[14]，從而機體長久保留了效應T淋巴細胞[15]。

肺部病變累及的面積常常反應結核病的嚴重程度。在本研究中，對24例病變累及4個肺段以上和82例不足4個肺段的肺結核患者抗原刺激的IFN-γ分泌量的比較上，其中ESAT-6和ESAT-6/CFP-10融合抗原無論在IFN-γ的分泌量和IFN-γ分泌的陽性率之間差異都有統計學意義；其可能的原因為在重癥肺結核患者中，細胞免疫功能受到抑制，CD4+T淋巴細胞的功能受到抑制[16]。

參與抗原特異IFN-γ分泌的效應T淋巴細胞主要是CD4+T淋巴細胞，因此，外周血淋巴細胞的絕對值可能對結果產生影響[17]。結果顯示，外周血淋巴細胞計數<1.0×109/L和外周血淋巴細胞計數≥1.0×109/L兩組之間抗原刺激的IFN-γ分泌量差異有統計學意義，提示外周血淋巴細胞的數量對試驗結果可能產生影響，相似的結論主要在HIV與Mtb雙重感染的人群中得到證實。

本研究旨在初步探討影響干擾素釋放試驗的因素，部分組別因選例困難導致入組人數偏少，需要進一步擴大樣本量探討陳舊性肺結核與活動性肺結核的干擾素釋放試驗的差異；此外，根據研究顯示，淋巴細胞數量對實驗結果有影響，下一步需要對淋巴細胞進行分組，進一步探討CD4+T淋巴細胞的數量對實驗結果的影響。

基于RD1區抗原刺激的全血γ干擾素釋放試驗在菌量負荷的影響因素下的IFN-γ分泌量差異無統計學意義，但是受到外周血淋巴細胞計數和病變累及程度的影響。各抗原對疾病的活動性表現不一，需要擴大樣本量進一步證實。

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