自生固氮菌活化土壤無機磷研究

張 亮，楊宇虹，李 倩，吳葉寬，黃建國，*

(1.西南大學資源環境學院，北碚 400716;2.云南省煙草農業研究院，玉溪 653100)

磷是植物生長必須的大量營養元素之一。大多數土壤的含磷量較低，且以難溶狀態存在［1］。磷肥施入土壤之后易形成難溶性的磷酸鹽并迅速被土壤礦物吸附固定或微生物固持，其當季利用率通常只有施用量的10%—20%［2］，活化利用土壤中的難溶性磷對于改善植物磷素營養有重要意義。微生物不同程度的參與土壤磷的活化，它們對土壤難溶性磷的溶解作用日益引起人們重視［3］。

目前，有關微生物活化土壤難溶性磷的研究多局限在芽孢桿菌(Bacillaceae)、真菌和放線菌［4］。前蘇聯蒙金娜于1935年最早從土壤中分離出1株解磷的巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)，具有分解核酸和卵磷脂的能力［5］。Sundara等利用磷酸三鈣為磷源，經過14 d的培養后發現芽孢桿菌和埃希氏菌的溶磷能力最強［6］。此外，某些真菌也具有溶解無機磷能力，它們主要是青霉屬(Penicillium)和AM菌根菌(Arbuscular mycorrhizal fungus);放線菌主要是鏈霉菌(Streptomyces)［7］。進一步的研究發現，溶磷微生物一般都能分泌有機酸，如甲酸、乙酸、檸檬酸和丁二酸等。在這些有機酸中，甲酸和乙酸的電離常數最大，能電離出氫離子，溶解氟磷灰石、氯磷灰石、羥磷灰石等磷酸鈣鹽，釋放磷酸根［8-9］;高碳有機酸能與鐵鋁形成穩定絡合物，進而溶解高磷鐵礦石、粉紅磷鐵礦、水鋁礦等鐵鋁磷酸鹽［10-11］。就自生固氮菌而言，它們不僅具有固氮作用而且還能溶解磷酸鹽，改善土壤供磷能力［12］，但溶磷機理尚待施入探討。從多方面研究自生固氮菌的生物學功能，可更全面地了解它們的生態作用，更好地為農林生產服務。

1 材料與方法

1.1 材料準備

自生固氮菌(Azotobacter sp.)保存于西南大學資源環境學院微生物實驗室，從重慶市北碚灰棕紫泥菜地土壤中分離獲取，菌種均已進行固氮酶活性的測定。取其中的5株為供試菌株，代號分為N 01、N 02、N 03、N 04和N 05。先將自生固氮菌固體培養基蒸汽滅菌((121±1)℃，30 min)，冷卻后接種供試菌株，(30±1)℃斜面培養4 d備用。正常培養基組成為:蒸餾水1000 mL、瓊脂20 g、葡萄糖10 g、KH2PO40.2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 0.2 g、CaSO4·7H2O 0.2 g、CaCO35.0 g、pH 值 7.0—7.2。然后，再接種到盛有 50 mL(KCl代替KH2PO4)的自生固氮菌液體培養基中，搖床培養((28±1)℃、60 r/min)3 d，獲得菌懸液備用。

供試土壤為侏羅紀紫色砂泥巖發育的灰棕紫泥。蒸汽滅菌后的土壤pH值6.15、有機質15.0 g/kg、全氮1.07 g/kg、全磷 0.89 g/kg、全鉀 16.3 g/kg、鋁磷 94.3 mg/kg、鐵磷 65.9 mg/kg、閉蓄態磷 130.8mg/kg、鈣磷274.0 mg/kg、有機磷320.8 mg/kg、有效磷20.0 mg/kg、速效鉀92.6 mg/kg。風干土壤，磨細過100目篩，取1.0000 g土壤置于兩端開口的直徑為1 cm的塑料管中部，然后兩端塞入玻璃纖維，將土壤夾在中間，再用孔徑為0.22 μm的微孔濾膜密封兩端，121℃蒸汽滅菌150 min。在振蕩培養自生固氮菌時，將盛有土壤的塑料管放入液體培養基中，水分子、無機離子和有機酸等均可自由進出，但土壤又不會穿過濾膜而進入溶液，自生固氮菌也不能穿過濾膜進入土壤中。

試驗中有機酸標準品為色譜純，其余試劑均為分析純。精確稱取草酸、檸檬酸、蘋果酸、丁二酸、乳酸、甲酸、乙酸各100 mg，用流動相溶解并定溶于100 mL容量瓶中，配置成1.0 g/L的有機酸的標準混合溶液，再用流動相將標準溶液分別稀釋至0.01、0.02、0.04、0.06、0.08和0.10 g/L。

1.2 試驗設計

取250 mL三角瓶，加入50 mL KCl代替KH2PO4的供試培養基，蒸汽滅菌((121±1)℃，30 min)，冷卻。接入1 mL 1.1中制備的菌懸液，再加1個裝有土壤的滅菌塑料管;不接種的液體培養基為對照，余同接種處理，重復6次。搖瓶培養((28±1)℃、60 r/min)7 d，備測有關項。

1.3 測定項目與方法

將液體培養基搖勻，用PHS-3C精密酸度計測定pH值;取10 mL液體培養基用H2SO4-H2O2消化，鉬藍比色法測定消化液的含磷量;另取20 mL將液體培養基于10000 r/min離心8 min，鉬藍比色法測定上清液的無機磷含量。

利用高效液相色譜儀(日本HITACHI公司生產)測定液體培養基中的有機酸含量。色譜條件為:Diode Array L-7455紫外檢測器，Ion-300有機酸分析專用柱 (Phenomenex，Torrance，CA，USA)，流動相為2.5 mmol/L硫酸，流速為0.5 mL/min，進樣量為20 μL樣液(樣液先經硫酸酸化)，紫外檢測波長為210 nm，柱溫為35℃，壓力為450 P。測定的有機酸包括草酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、丁二酸、甲酸、乙酸，其出峰時間(min)依次是 9.57、11.52、13.31、14.53、15.95、17.47、20.72(圖 1)。

圖1 有機酸的標準色譜圖Fig.1 Standard chromatogram of organic acids

從塑料管中取出土壤，風干后用Olsen法提取，鉬藍比色法測定土壤中的有效磷含量［13］;土壤無機磷組分測定:采用張守敬和Jackson提出的方法［14］。該方法將土壤無機磷分為:1 mol/L NH4C1浸提疏松態磷，0.5 mol/L NH4F浸提Al-P，0.1 mol/L NaOH浸提Fe-P，0.3 mol/L檸檬酸鈉+1.0 g Na2S2O4+0.5 mol/L NaOH浸提的閉蓄態磷(O-P)，0.5 mol/L(1/2H2SO4)浸提Ca-P。

1.4 數據處理

用Excel2003對試驗數據進行基本計算，SPSS18.0進行統計分析，不同處理間的差異顯著性用單因素方差分析進行比較，使用Pearson法進行雙因素相關分析。

2 結果

2.1 自生固氮菌對培養基pH值的影響

圖2可見，培養7 d之后，液體培養基的pH值顯著低于對照(不接種)，但菌株不同，液體培養基的pH值降幅也不一樣。接種N 02之后，液體培養基的pH值為3.45，降幅最大;接種N 04，液體培養基的pH值為5.45，降幅最小;其余菌株培養基的pH值介于3.50和4.00之間。

2.2 自生固氮菌的有機酸分泌

表1可見，在液體培養基中檢測到甲酸、乙酸、草酸、乳酸、丁二酸、檸檬酸、蘋果酸等7種有機酸。在不接種的液體培養基中(對照)，檢測到草酸、蘋果酸和丁二酸，但含量極低，可忽略不計。值得注意的是，自生固氮菌不同菌株分泌有機酸的種類和數量也不一樣。在接種自生固氮菌的液體培養基中，草酸和蘋果酸的含量顯著高于對照，說明自生固氮菌均能分泌草酸和蘋果酸，其中草酸分泌量普遍最高;此外，大多數自生固氮菌能分泌丁二酸和甲酸(N 04除外)，N 01、N 03、N 05能分泌乙酸;N 02、N 03、N 05能分泌檸檬酸;N 02和N 04能分泌乳酸。從5種有機酸的總量看，N 03的分泌量最高，N 01次之，N 02和 N 05居第三，N 04最低。

圖2 液體培養基中pH變化Fig.2 The changes in pH in liquid culture mediums

表1 液體培養基中有機酸的含量Table 1 Contents of organic acids in liquid culture mediums/(mg/L)

2.3 培養基中磷的形態與含量

表2可見，培養7 d之后，液體培養基中的無機磷含量因菌株不同而異。在接種N 02、N 03和N 05的液體培養基中，無機磷含量顯著高于對照組，分別比對照提高28.54%(N 02)、21.12%(N 03)和15.73%(N 05);其余菌株培養基中的無機磷含量與對照相似，變化于4.58—4.82 mg/L之間。

表2 自生固氮菌培養液中的磷形態與含量Table 2 Phosphorus forms and contents in the liquid culture mediums grown with Azotobacter sp./(mg/L)

在接種自生固氮菌的液體培養基中，全磷含量均顯著高于對照，比對照提高25.42%—50.53%，但接種不同菌株之間無顯著差異，變化于8.24—9.89 mg/L之間(表2)。

培養基中的全磷減無機磷等于有機磷，少量是自生固氮分泌的有機磷，大部分存在于自生固氮菌細胞中(簡稱自生固氮菌細胞磷)。全部接種菌株的液體培養基中有機磷含量均顯著高于對照，比對照提高72.64%—96.70%(表2)。

2.4 土壤有效磷

圖3可見，土壤有效磷的含量因自生固氮菌菌株不同而異。與不接種相比，N 01和N 05顯著增加土壤有效磷含量，培養7 d后分別增加了28.01%和22.06%，其余菌株土壤中的有效磷與對照相似。

2.5 土壤無機磷的組分與含量

培養7 d之后，土壤無機磷組分及含量見表3。在液體培養基中接種自生固氮菌，土壤鋁磷、鐵磷、鈣磷和閉蓄態磷不同程度地降低。其中，除N 04之外，4株自生固氮菌顯著降低土壤中的鋁磷，降幅變化于22.03%—29.19%之間。除N 04和N 05之外，3株自生固氮菌顯著降低土壤中的鐵磷，降幅變化于6.52%—9.60%之間。除N 04之外，4株自生固氮菌顯著降低土壤中的閉蓄態磷，降幅變化于16.94%—24.39%之間。全部接種菌株顯著降低土壤中的鈣磷，降幅變化于8.15%—17.89%之間。從土壤無機磷總量看，自生固氮菌均能顯著降低土壤中的無機磷總量，降幅變化于8.11%—19.54%之間。此外，菌株不同，土壤無機磷各組分的降幅也不一樣。就土壤無機磷總量而言，N 02降幅最大，N 04降幅最低，其余菌株介于二者之間。

圖3 土壤中有效磷含量變化Fig.3 The changes in available phosphorus in soils

表3 土壤中無機磷組分的變化Table 3 The changes in inorganic phosphorus fractions in soil/(mg/kg)

2.6 各因素的相關分析

表4可見，培養液中的pH值與培養液中的無機磷和全磷呈顯著或極顯著負相關(r=-0.850*和r=-0.918＊＊，n=6，與土壤無機磷總量呈極顯著正相關(r=0.959＊＊，n=6);自生固氮菌的草酸分泌量與有機酸分泌總量呈極顯著正相關(r=0.991＊＊，n=6)。

表4 試驗各因素的相關系數Table 4 Correlation coefficients among experimental factors

3 討論

液體培養基中的全磷包括無機磷和有機磷，后者主要存在于自生固氮菌細胞中(簡稱自生固氮菌細胞磷)。在部分自生固氮菌液體培養基中，無機磷顯著增加;在全部自生固氮菌液體培養基中，自生固氮菌細胞磷和培養液中的全磷含量均顯著高于對照。與此同時，土壤無機磷總量(鐵磷、鋁磷、閉蓄態磷、鈣磷四者之和)則顯著降低。由于土壤磷是培養基磷的唯一來源，說明自生固氮菌可促進土壤無機磷的溶解釋放，以無機磷或自生固氮菌細胞磷的形式存在于液體培養基中。值得注意的是，在全部自生固氮菌的液體培養基中，土壤鈣磷顯著降低。由于氫離子的釋放有利于鈣鎂磷酸鹽的溶解［15-16］，這說明自生固氮菌能分泌大量的氫離子，也是自生固氮菌活化無機磷能力較強的原因之一。此外，自生固氮菌因菌株不同，土壤中的閉蓄態磷、鐵磷、鋁磷發生不同程度的降低，說明自生固氮菌活化土壤不同形態的無機磷因菌株不同而異。在接種N 01和N 05的處理中，土壤有效磷含量顯著增加;而在接種其余菌株的處理之中，土壤有效磷含量無顯著變化，進一步說明自生固氮菌菌株不同活化釋放無機磷的能力也不一樣。

磷細菌能夠分泌草酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸等多種有機酸，不同菌株之間差異很大［17］;有研究者認為解磷細菌的溶磷能力與培養液中的介質有關，磷細菌通過NH+4的同化作用釋放出質子，降低pH值，從而引起磷酸鹽的溶解［18］。Wallander曾報道，溶磷微生物通過呼吸作用釋放CO2，能降低培養液中的pH值，從而釋放出磷酸根離子［19］。Whitelaw等［20］發現磷細菌溶解難溶性磷酸鹽時，是培養液中氫離子和有機酸共同作用的結果。Hameeda等［21］研究表明，微生物溶解無機磷的能力與其產生葡萄糖酸的量有一定的關系，解無機磷能力強的菌株，其相應的產生葡萄糖酸的量也多，并且還發現在培養過程中pH值是降低的。在本試驗中，全部菌株均能分泌草酸和檸檬酸。此外，大多數自生固氮菌能分泌丁二酸和甲酸(N 04除外)，因菌株不同分泌乙酸、檸檬酸和乳酸的情況而異，這說明不同的菌株溶磷機理可能有所差異。需要指出的是，草酸分泌量與有機酸分泌總量呈極顯著正相關(r=0.991＊＊，n=6)，自生固氮菌的草酸分泌量普遍最高。由于草酸(HOOC—COOH)中的兩個羧基的電子互相吸引，產生共軛作用，其酸度約是甲酸的100倍，乙酸的1000倍;乙酸也屬于較強的有機酸，其電離常數為1.8×10-5(25℃)，大于碳酸(4.3×10-7)100倍，推測草酸在活化土壤無機磷的過程中可能起重要作用。

供試自生固氮菌菌株顯著降低液體培養基中的pH值，至少降低了1.76個單位，即氫離子濃度增加約58倍。但是，接種自生固氮菌之后，液體培養基中的有機酸最高僅增加7.19倍(N 03)，推測自生固氮菌分泌氫離子的數量可能遠遠超過所有機酸離解產生的氫離子。有研究表明，豆科植物在低磷環境中能向周圍土壤中分泌氫離子和有機酸，進而溶解土壤中的難溶性磷，改善植物的磷素營養［22］。相關分析表明，培養液中的pH值與培養液中的無機磷和全磷呈顯著或極顯著負相關(r=-0.850*和r=-0.918＊＊，n=6)，這說明培養液中pH值的降低是導致土壤無機磷向培養液中釋放磷酸根的直接原因;并且培養基的pH值與土壤無機磷總量呈極顯著正相關(r=0.959＊＊，n=6)，溶解鈣鎂磷酸鹽的機理可能與自生固氮菌細胞的質子分泌有關。因為在酸性條件下，鈣鎂磷酸鹽溶解度提高。這可能是部分豆科植物改善土壤磷素營養的原因之一。與此同時，鋁磷、鐵磷和閉蓄態磷的溶解可能與高碳有機酸的分泌密切相關。因為檸檬酸和草酸絡合Fe3+和Al3+的能力極強，并且 Fe3+、Al3+分別和檸檬酸、草酸的 logK穩最低為 7.26，最高達到 25.00［23］。其中，［Al(C2O4)3］3-和［Fe(C2O4)3］3-的穩定常數分別為2.0×1016和3.9×1016。所以，草酸能絡合鐵鋁磷酸鹽和鐵鋁氧化物膠膜中的Al3+、Fe3+，導致鐵鋁磷酸鹽和閉蓄態磷釋放，提高生物有效性［24］。考慮到試驗中自生固氮菌的草酸分泌量占有機酸分泌總量的比重大，推測草酸的分泌在活化土壤無機磷的過程中可能起著至關重要的作用。有學者研究表明，磷細菌在生長過程中分泌到介質中的草酸、檸檬酸和蘋果酸是溶解鋁磷和鐵磷的主要原因［25-26］。并且，有研究表明，直接向含有難溶性磷酸鹽的紅壤中加入草酸、蘋果酸等有機酸，發現培養液中的可溶性磷含量顯著增加［27］，這直接說明有機酸對難溶性磷酸鹽有活化作用。試驗中自生固氮菌與大多數磷細菌一樣，都能分泌有機酸，產生相似溶磷機理。除此之外，自生固氮菌還能直接分泌氫離子，直接溶解鈣鎂磷酸鹽。因此，自生固氮菌兼具分泌氫離子和多種有機酸的能力，以多種方式活化土壤不同形態的無機磷，促進周圍植物的生長。這一點也得到了證實，有學者曾將自生固氮菌接種到楊柴根際的土壤中，對其有明顯的促生作用，同時提高了土壤有效磷的活性［28］。

總之，自生固氮菌除固氮活性之外，還具有活化土壤無機磷的作用。因菌株不同，它們以不同的方式活化土壤中的鋁磷、鐵磷、閉蓄態磷、鈣磷，導致自生固氮菌的溶磷機理出現了多樣性。

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