大青葉等清熱藥對HaCaT細胞增殖的影響

鄭明警 浙江中醫藥大學第一臨床醫學院 杭州 310053

馬麗俐 浙江省中醫院

大青葉等清熱藥對HaCaT細胞增殖的影響

鄭明警 浙江中醫藥大學第一臨床醫學院 杭州 310053

馬麗俐 浙江省中醫院

目的：觀察單味清熱類中藥大青葉、水牛角、龍膽草、生地、黃芩提取物對HaCaT細胞增殖的影響。方法：用MTT法檢測上述單味清熱類中藥提取物對HaCat細胞的24h抑制率。結果：大青葉、龍膽草、黃芩、生地提取物具有抑制HaCaT細胞增殖作用，且與藥物濃度具有一定相關性；水牛角提取物具有促進HaCaT細胞增殖作用，且與藥物濃度具有一定相關性，與空白對照組比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。結論:抑制角質形成細胞增殖可能是大青葉、生地、黃芩、龍膽草治療銀屑病的作用機制之一，水牛角治療銀屑病的作用與抑制角質形成細胞增殖無關。

銀屑病 HaCaT細胞 清熱類中藥

銀屑病是一種慢性復發性皮膚疾病。病理學表現為表皮角質形成細胞過度增殖[1-3]及異常分化，炎癥細胞浸潤，真皮血管增生。臨床表現為紅色斑塊，覆有多層銀白色的鱗屑。角質形成細胞功能改變在銀屑病的發病中具有重要作用[3]。HaCaT細胞是成人皮膚中分離得到的一種永生化的角質形成細胞株，與正常人角質形成細胞增殖、分化特性相似，遺傳特性穩定，現常用來替代人表皮角質形成細胞進行實驗研究[4]。本實驗旨在觀察清熱類中藥大青葉、水牛角、龍膽草、生地、黃芩提取物對HaCaT的增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 HaCaT細胞由浙江省中醫藥大學附屬第一醫院中心實驗室提供，大青葉、水牛角、龍膽草、生地、黃芩中藥提取物購自浙江省中藥研究所，1640培養液購自Hylcone，胎牛血清購自杭州四季青公司，0.25%含EDTA胰酶購自吉諾公司，rhEGF購自Sino Biological Inc。

1.2 HaCaT細胞培養 HaCaT細胞用含10%胎牛血清的1640培養液培養于37℃ CO2培養箱，定時換液、傳代培養。

1.3 MTT法檢測HaCaT細胞增殖 將處于對數生長期的HaCaT細胞以1×104/孔密度接種至96孔板，置于CO2培養箱內培養24h后，換含20ng/mL的rhEGF的培養液，繼續培養24h，設空白對照組、大青葉、生地、龍膽草、生地、黃芩五個加藥組，加藥組換1640稀釋藥物配成的培養液，每一個濃度設5個復孔（統計結果時去掉最高和最低值）。24h后，每孔MTT（5mg/ mL）20μL，37℃培養箱培養4h后終止培養，2000rpm離心10min，棄去培養液，每孔加入DMSO150μL，置細胞板蕩器振蕩10min，在酶聯免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值（OD值）。

1.4 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件，采用方差分析。

表1 大青葉提取物對HaCaT細胞增殖的影響（±s）

表1 大青葉提取物對HaCaT細胞增殖的影響（±s）

注：與空白對照組比較，△P＜0.05

組別空白對照組大青葉提取物組n333333濃度/（mg/mL）081 6 24 32 40 OD值0.412±0.060 0.284±0.010△0.304±0.008△0.235±0.012△0.120±0.012△0.100±0.013△

表2 龍膽草提取物對HaCat細胞增殖的影響（±s）

表2 龍膽草提取物對HaCat細胞增殖的影響（±s）

注：與空白對照組比較，△P＜0.05

組別空白對照組龍膽草提取物組n333333濃度/（mg/mL）0 10 20 30 40 50 OD值1.096±0.011 0.960±0.016△0.831±0.007△0.531±0.008△0.379±0.009△0.110±0.010△

表3 水牛角提取物對HaCaT細胞增殖的影響（±s）

表3 水牛角提取物對HaCaT細胞增殖的影響（±s）

注：與空白對照組比較，△P＜0.05

組別空白對照組水牛角提取物組n3333濃度/（mg/mL）0 70 80 90 OD值0.467±0.008 0.519±0.007△0.686±0.005△0.857±0.013△

表4 黃芩提取物對HaCaT細胞增殖的影響（±s）

表4 黃芩提取物對HaCaT細胞增殖的影響（±s）

注：與空白對照組比較，△P＜0.05

組別空白對照組黃芩提取物組n333333濃度/（mg/mL）0 50 60 70 80 90 OD值1.257±0.007 0.414±0.006△0.357±0.005△0.331±0.003△0.325±0.006△0.301±0.008△

2 實驗結果

大青葉、龍膽草、黃芩、生地提取物對HaCaT細胞都有一定的抑制作用，且抑制率隨藥物濃度的增加而增加。水牛角提取物對HaCaT細胞具有一定促進生長作用，且在一定濃度范圍內，隨藥物濃度增加，促進生長作用加強。見表1～5，圖1～7。

表5 生地提取物對HaCaT細胞增殖的影響

圖1 空白對照組細胞邊境清楚，長勢良好

圖2 8mg/mL大青葉提取物作用24h后，大部分細胞仍保持正常的細胞形態，少量細胞明顯變圓，呈空泡狀。

圖3 40mg/m L大青葉提取物作用24h后，大量細胞明顯變圓，呈空泡狀，貼壁不牢，或漂浮。

圖4 40mg/mL龍膽草提取物作用24h后，大量細胞明顯變圓，呈空泡狀，貼壁不牢，或漂浮。

圖5 90mg/mL水牛角提取物作用24h后，細胞邊境清楚，長勢良好，較空白對照組細胞更密集。

圖6 90mg/mL黃芩提取物作用24h后，細胞邊界模糊，貼壁不牢。

圖7 90mg/mL生地提取物作用24h，部分細胞邊界模糊。

3 討論

銀屑病中醫稱之為白疕，其進展期臨床多為里熱熾盛，臨床上常用清熱類中藥對癥治療，療效確切。馬麗俐等[5]用清熱涼血方治療血熱型銀屑病31例，治療后患者的PASI指數較治療前明顯降低（P＜0.01）。“白疕一號”、“消銀解毒湯”、“克銀一號”等諸多方劑均用到大青葉、水牛角、龍膽草、生地、黃芩等中藥[6-8]。本實驗選取的單味清熱類中藥均為里熱證銀屑病常用藥物。

中藥提取物作用于細胞已經是一種很普遍的實驗方法[9-10]。研究表明，銀屑病患者角質形成細胞VEGF表達明顯高于健康人[11]，而EGF及其受體在銀屑病的表皮過度增殖中起著關鍵作用，是引起該病重要的致病因子之一[12]。本實驗用rhEGF刺激Ha?CaT細胞使其處于過度增殖狀態，模擬銀屑病患者角質形成細胞過度增殖的情況[13]。并通過MTT方法觀察5種清熱類中藥對HaCaT細胞活性的影響。結果顯示，大青葉、龍膽草、黃芩、生地黃提取物對HaCaT細胞增殖都有一定的抑制作用。說明大青葉、龍膽草、黃芩、生地能抑制HaCaT細胞的增殖，其作用強度與藥物濃度和作用時間有關。抑制角質形成細胞的增殖可能是大青葉、龍膽草、黃芩、生地治療銀屑病的作用機制之一。但是水牛角對HaCaT細胞增殖無抑制作用，表明水牛角治療銀屑病的作用機制可能與大青葉、龍膽草等不同。抗炎、降低毛細血管通透性可能為水牛角治療銀屑病的作用機制之一[14-17]。

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Effect of Chinese Herbs w ith Properties of Clearing away Heat on the Proliferation of HaCaT Cells

ZHENG Ming-jing,MA Li-li.The First College of Clinical Medicine,Zhejiang Traditional Chinese Medicine Uni?versity,Hangzhou(310053),China

Objective:To investigate the influence of folium,buffalo horn,gentian,habitat,and skullcap extracts on the proliferation of HaCaT cells.M ethods:The 24h inhibitory rate of HaCaT cell proliferation by the above mentioned Chinese herbs was examined by the MTT method.Results:Folium,gentian,skullcap,and habitat ex?tracts inhibited the proliferation of HaCaT cells in a dose-dependent manner,while buffalo horn extract advanced the proliferation of the cells in a dose-dependent manner,and these results were all significantly different as compared to blank control groups(P＜0.05).Conclusion:One of the mechanisms by which folium,buffalo horn, gentian,and skullcap treat psoriasis may be inhibiting the proliferation of malpighian cells,while buffalo horn does not have the same effect when being used to treat psoriasis.

psoriasis HaCaT cells Chinese herbs with properties of clearing away heat

2012-11-05

浙江省自然科學基金項目（No.Y2091225）

馬麗俐，Tel:13858022185，E-mail:Ma-lil@ihotmai.l.com