蓮房原花青素對極低頻電磁場致星形膠質細胞氧化損傷的預防作用

張 瑞，段玉清，武 妍，張海暉，施嵐晨，楊 玲，陸榮柱

(1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江212013;2.江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院預防醫學教研室，江蘇鎮江212013)

極低頻電磁場(extremelylowfrequency electromagnetic fields，ELF-EMF)是頻譜在 0～300Hz的電磁波發出的以非熱效應為主的非電離輻射［1］，主要由電力供應設備、電腦、手機及各種家用電器產生，是與我們日常生活和工作最為密切的電磁場之一。眾多流行病和動物實驗研究表明，長期暴露在ELF-EMF下，可造成中樞神經系統、免疫系統和生殖系統等功能障礙。其中腦部中樞神經系統需氧量大、不飽和脂肪酸含量高以及抗氧化防御系統薄弱等特點致使其對ELF-EMF最為敏感，最易受ROS攻擊產生氧化應激損傷［2］。ELF-EMF誘發腦氧化應激導致抗氧化酶活力降低和脂質過氧化的研究報道較多［2-6］，但目前仍集中在健康風險的評估，缺少評估后防護措施的研究報道。ELF-EMF對人類健康尤其是腦部功能將構成極大的威脅，為了提高國民整體健康水平，必須采取多渠道的措施預防ELFEMF對健康的不利影響。其中在日常飲食中添加活性物質來強化飲食，作為預防ELF-EMF所致的疾病是一種行之有效的方法，但目前僅有Ilhan等報道銀杏葉提取物能調節大鼠腦內抗氧化酶活性，預防ELF-EMF對腦的氧化應激損傷［4］。Amara等［5］和 Ghodbane［6］等分別報道補充鋅和硒能改善ELF-EMF對腦內抗氧化酶活性的影響。蓮房原花青素(procyanidins from lotus seedpod，LSPC)是課題組從睡蓮科植物蓮的成熟花托中分離的主要活性成分之一，是由兒茶素或表兒茶素以 C4-C8或C4-C6鍵連接而成的2～4聚體所組成。現已證實LSPC在體內外均具有很強的清除自由基和抗氧化活性［7］，并對損傷極強的電離輻射有顯著的防護作用，而且抗氧化應激是其防護機制之一［8］。而原花青素作為公認的強抗氧化劑和自由基清除劑，目前卻未涉及對ELF-EMF的研究報道。星形膠質細胞是中樞神經系統中最多的細胞，能參與神經元突觸形成及調節［9］，促進神經干細胞和神經前體細胞的分化［10］，所以星形膠質細胞是否正常生長直接關系著腦功能。故本實驗以星形膠質細胞為模型，探討LSPC對ELF-EMF致星形膠質細胞氧化應激損傷的預防作用。為其預防機制的深入研究提供參考，最終為其在食品和保健品行業的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗動物 出生24h以內SD乳鼠(動物生產許可證號:SCXK-(蘇)2009-0002)由江蘇大學實驗動物中心提供;蓮房原花青素 本實驗室自制，純度＞95%;高糖DMEM培養粉、新生牛血清 GIBCO公司;胰蛋白酶 Sigma公司;二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(MTT)、SOD試劑盒、MDA試劑盒、ROS試劑盒、Ca2+試劑盒 南京建成生物工程研究所。

Multiskan Spectrum型全波長酶標儀 美國熱電公司;Spectra Max Gemini熒光酶標儀 美國Molecular Device公司;德國Leica TCS SP5Ⅱ型激光共聚焦顯微鏡 德國萊卡顯微系統有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 星形膠質細胞的原代培養及鑒定 出生24h內的SD乳鼠，70%醫用酒精消毒后，無菌條件下斷頭分離大腦皮層，去掉腦膜、小腦和血管，胰酶消化之后，1000r/min離心5min。去上清，加入培養液(DMEM培養液+20%小牛血清)，用吹管吹打均勻。調整密度為1×106個/mL，將細胞懸液接種至預先鋪有多聚賴氨酸的6孔培養板中，置于37℃、5%的CO2、飽和濕度的CO2培養箱中培養，24h后換液，以后每2～3d換液一次。細胞培養至12～14d，可用于實驗。用星形膠質細胞的標志蛋白(GFAP)進行免疫細胞化學鑒定，95%以上為陽性細胞［11］。

1.2.2 輻射裝置 實驗采用極低頻電磁場發生器，場強可通過調節電壓控制。該儀器由兩圓形Helmholt線圈和調壓器構成，線圈外徑為13cm，內徑為9cm，匝數為400。樣品細胞培養板置于兩圓形線圈之間。兩線圈通以同方向50Hz的交流電，中心區域可產生交變電磁場。

1.2.3 細胞損傷模型的建立 將處于對數生長期的星形膠質細胞分為正常組和輻射組，其中正常組不做任何處理，輻射組分別在不同磁場強度(2、4、6、8、10mT)下輻射不同時間(60、90、120min)，建立 ELFEMF致星形膠質細胞損傷的模型，選出ELF-EMF的最佳輻射場強和時間。

1.2.4 細胞生存率測定 采用MTT法檢測細胞生存率。將星形膠質細胞以1×105個/mL密度接種至預先包被賴氨酸的96孔板中，待細胞處于對數生長期，分為正常組和輻射組。細胞按1.2.3方法分組輻射后，37℃孵育24h，吸出培養液，PBS洗2遍，加入MTT(5g/L)40μL，繼續培養4h后，吸去上清，每孔加入150μL二甲基亞砜(DMSO)，充分振蕩10min，用全波長酶標儀在570nm波長下測定各孔吸光度。每組設6個復孔。按式(1)計算細胞生存率:

1.2.5 LSPC對ELF-EMF致星形膠質細胞損傷的預防實驗 將96孔板中培養至第12d的星形膠質細胞隨機分為正常對照組、輻射對照組和LSPC預防組，其中正常對照組不做任何處理，輻射對照組和LSPC組均在場強8mT下連續輻射90min，LSPC預防組預先分別加入終濃度為5、10、20μg/mL的 LSPC共同培養8h后輻射，輻射后將細胞置于CO2培養箱中繼續培養24h后，MTT法檢測細胞生存率。

1.2.6 細胞內SOD和MDA含量測定 將星形膠質細胞以1×105個/mL密度接種至預先包被賴氨酸的24孔板中，待細胞處于對數生長期，分為正常對照組、輻射對照組和LSPC預防組。同1.2.5法處理細胞，培養結束后吸去培養液，加入細胞裂解液，置于冰上裂解 30min。刮下細胞，收集于 EP管中，12000r/min冷凍離心。吸取上清液，分別采用試劑盒的方法檢測SOD和MDA含量。

1.2.7 細胞內ROS含量和分布 將24孔板中培養至第12d的星形膠質細胞隨機分為正常對照組、輻射對照組和LSPC預防組。同1.2.5法處理細胞，培養結束后吸去培養液，加入無血清培養基稀釋的DCFH-DA溶液，終濃度為10μmol/L，37℃下負載探針30min，PBS洗滌2次，采用熒光酶標儀檢測細胞內ROS含量，每組測定104個細胞的熒光強度。激光共聚焦顯微鏡下拍照，激發光波長488nm，發射光波長525nm。

1.2.8 細胞內Ca2+含量測定 將24孔板中培養至第12d的星形膠質細胞隨機分為正常對照組、輻射對照組和LSPC預防組。同1.2.5法處理細胞，培養結束后吸去培養液，加入5μmol/L Fluo-3AM染液，37℃孵育40min，PBS洗2次，激光掃描共聚焦顯微鏡測量。選用氬離子激光器，激發波長488nm，通過LaserSharp軟件采集圖像，運用圖像分析軟件LaserPix進行定量分析，每組測定50個細胞的相對熒光強度值，以相對熒光強度值代表細胞內游離Ca2+濃度。

2 結果與分析

2.1 ELF－EMF致星形膠質細胞損傷模型

表1為不同輻射場強和時間下星形膠質細胞的生存率。由表1可見，同一場強條件下，隨著ELFEMF輻射時間增加，星形膠質細胞的生存率呈下降趨勢。相同時間條件下，星形膠質細胞生存率隨輻射強度增加呈下降趨勢。當輻射時間為90min，磁場強度增大到8、10mT時，細胞生存率分別為53.22%和52.57%，與對照組相比均存在極顯著性差異(p＜0.01)。因此，選取8mT下輻射90min為ELF-EMF致星形膠質細胞輻射損傷條件。

表1 不同輻射場強和時間對星形膠質細胞生存率影響(±s，n=6)Table 1 Effect of different field strength and time on astrocytes survival rates(±s，n=6)

表1 不同輻射場強和時間對星形膠質細胞生存率影響(±s，n=6)Table 1 Effect of different field strength and time on astrocytes survival rates(±s，n=6)

注:與正常對照組相比，*p＜0.05，＊＊p＜0.01。

場強(mT)細胞生存率(%)60min 90min 120min正常對照組100.00±1.49 100.00±2.67 100.00±2.41 2 90.28±2.21 84.53±3.13* 74.87±4.30*4 86.73±1.32* 77.47±2.45* 65.11±1.47＊＊6 82.04±3.30* 65.10±2.39＊＊ 52.10±3.25＊＊8 73.09±2.43＊＊ 53.22±1.23＊＊ 47.21 ±1.32＊＊10 69.86±2.16＊＊ 52.57±1.14＊＊ 49.18±4.26＊＊

2.2 LSPC對ELF－EMF致星形膠質細胞損傷的預防作用

表2為LSPC預處理后星形膠質細胞的生存率。由表2可見，在實驗濃度范圍內，LSPC對正常星形膠質細胞生長無明顯影響(p＞0.05)。而經ELF-EMF輻射后，細胞生存率顯著下降(p＜0.01)，經過不同濃度LSPC預處理后星形膠質細胞的生存率呈上升趨勢，與輻射組相比具有顯著性差異(p＜0.05)。提示在實驗濃度范圍內LSPC對ELF-EMF致星形膠質細胞損傷具有一定的預防作用。

2.3 細胞內ROS含量和分布

本身沒有熒光的DCFH-DA可穿過細胞膜進入細胞，被細胞內酯酶水解轉化生成DCFH，被ROS氧化生成綠色熒光物質DCF，其熒光強度和細胞內ROS水平成正比。由表3和圖1可見，正常細胞中ROS含量處于相對較低的水平(圖1A)，而 ELFEMF輻射后，細胞內ROS含量與正常對照組相比極顯著升高(p＜0.01)(圖1B)，說明經ELF-EMF輻射后細胞內產生了過多的ROS。而經LSPC預處理后再輻射的細胞內ROS含量均有所下降(圖1C～E)，其中20μg/mL LSPC處理組ROS下降最多，與模型組相比存在極顯著性差異(p＜0.01)。說明LSPC能預防并減少ELF-EMF所產生的ROS。

表2 LSPC對ELF-EMF致星形膠質細胞損傷的預防作用(±s，n=6)Table 2 Effect of LSPC on the viability of ELF-EMF-injured astrocytes(±s，n=6)

表2 LSPC對ELF-EMF致星形膠質細胞損傷的預防作用(±s，n=6)Table 2 Effect of LSPC on the viability of ELF-EMF-injured astrocytes(±s，n=6)

注:a:表示模型組存活率，與正常對照組相比，*p＜0.05，＊＊p＜0.01;與模型組相比，Δp＜0.05，ΔΔp＜0.01;表3 同。

LSPC濃度(μg/mL)正常組存活率(%)LSPC預防組存活率(%)0 100.00±1.43 54.38±2.75＊＊a 100.20 ±3.91 65.09 ±1.27＊＊Δ 10 101.89 ±2.41 75.34 ±2.01＊＊ΔΔ 20 100.17±1.22 90.78±1.39*ΔΔ 5

圖1 星形膠質細胞內ROS的分布(×200)Fig.1 ROS assessment of astrocytes by DCFH-DA labeling(×200)

2.4 星形膠質細胞內SOD活力和MDA含量

經LSPC預處理前后的星形膠質細胞內SOD活力和MDA含量變化如表3所示。與正常對照組相比，模型組細胞內SOD活力極顯著降低(p＜0.01)，MDA含量極顯著升高(p＜0.01)，SOD活力下降一方面可能因為ELF-EMF輻照后細胞內產生過多的ROS，SOD為清除ROS而消耗;另一方面可能是經ELF-EMF輻照后直接導致細胞內的SOD含量下降所致。MDA含量增高說明過多的ROS使細胞發生脂質過氧化。而經LSPC預防組SOD活力隨其濃度的增加而逐漸增強，MDA的含量隨之下降，其中20μg/mL LSPC預處理組效果最顯著(p＜0.01)。說明經LSPC預處理后，能預防ELF-EMF對SOD的破壞，同時降低細胞內MDA的產生。

2.5 星形膠質細胞內Ca2+含量

Fluo-3AM熒光探針能穿透細胞膜進入細胞，與鈣離子結合形成Fluo-3-Ca2+復合物，該復合物具有綠色熒光，其相對熒光強度呈Ca2+依賴性，可以用相對熒光強度值代表胞內Ca2+含量。由表3可見，與對照組相比，模型組細胞內Ca2+含量極顯著升高(p＜0.01)。LSPC預處理組能顯著抑制細胞內Ca2+升高而且存在劑量-效應關系。結合之前實驗結果可知，ELF-EMF可導致星形膠質細胞氧化應激，生成過量的自由基，后者可引起生物膜功能的改變，造成離子通道受損，細胞外鈣離子大量內流，使其嘌呤氧化酶含量增多，導致更多自由基生成，進一步加重氧化損傷［12］。

表3 LSPC對細胞內SOD活力、MDA含量、ROS和Ca2+熒光強度的影響(±s，n=6)Table 3 Changes of the concentration of SOD and MDA，the fluorescence intensity of ROS and Ca2+of astrocytes in each group(±s，n=6)

表3 LSPC對細胞內SOD活力、MDA含量、ROS和Ca2+熒光強度的影響(±s，n=6)Table 3 Changes of the concentration of SOD and MDA，the fluorescence intensity of ROS and Ca2+of astrocytes in each group(±s，n=6)

.37模型對照組 11.75±0.58＊＊ 2.95±1.28＊＊ 307.19±16.28＊＊ 159.52±17.34＊＊模型 +5μg/mL LSPC 組 12.44±1.74＊＊ 2.67±0.74＊＊Δ 246.07±21.74＊＊ΔΔ 127.69±12.09＊＊ΔΔ模型 +10μg/mL LSPC 組 13.83±0.95＊＊Δ 1.26 ±0.55＊＊ΔΔ 215.20 ±20.55＊＊ΔΔ 110.66 ±13.54＊＊ΔΔ模型+20μg/mL LSPC組 17.27±1.83ΔΔ 0.99±0.35*ΔΔ 166.05±13.50*ΔΔ 92.05±15.27*ΔΔ熒光強度正常對照組 18.45±1.35 0.83±0.21 149.33±10.15 83.47±10組別 SOD活力(U/mgprot)MDA含量(U/mgprot)DCF熒光強度(104cells)Fluo-3-Ca2+

3 討論

已有文獻研究表明，原花青素對輻射損傷具有一定的保護作用［13-14］，但采用原代培養的大鼠星形膠質細胞為模型，考察LSPC對ELF-EMF損傷的預防作用尚未見報道。

氧化應激及自由基的堆積在誘發神經變性疾病方面起著重要作用。正常生理條件下，細胞內源生成的ROS除具有生理活性外，多余的ROS可被細胞內的抗氧化物質和抗氧化物酶及時清除，以維持細胞內氧化還原平衡狀態。當機體受到ELF-EMF輻照后，細胞內生成過多的ROS，這種平衡即被打破，導致細胞產生氧化應激損傷。SOD是機體細胞抵御氧化損傷最重要的酶類之一，主要清除體內有氧代謝所產生的超氧陰離子自由基，使機體免受損害［15］。MDA是脂質過氧化產物，可反映機體脂質過氧化程度［16］。本實驗發現，電磁輻射可引起細胞SOD活力下降，ROS和MDA含量升高，而加入LSPC預處理后，SOD活力、ROS和MDA含量均較模型組明顯改善。提示LSPC具有預防ELF-EMF致星形膠質細胞氧化應激損傷的活性。

Ca2+是參與細胞各種生理活動的重要離子之一，在細胞調節中的功能是多方面的。近年的研究提出了許多關于細胞內Ca2+濃度升高引起細胞損傷甚至死亡的機制，主要認為Ca2+上升能導致細胞能量代謝障礙，觸發一系列酶促反應，促進氧自由基生成［17］、激活非選擇性氧離子通道等途徑產生細胞毒性作用，最終影響細胞的功能。實驗結果顯示，電磁輻射導致細胞內Ca2+超載，進一步刺激ROS產生，造成對細胞的氧化損傷，而加入LSPC預處理后可有效抑制Ca2+含量上升，從而預防細胞損傷。

4 結論

氧化應激可能是ELF-EMF對細胞損傷作用的機制之一。LSPC對ELF-EMF造成星形膠質細胞氧化損傷具有明顯的預防作用，其作用可能與LSPC清除自由基和抗氧化活性有關。

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