DEN誘發PLCε基因敲除小鼠肝癌模型的建立

崔 智，李瑞生，李曉娟，胡 燕，戴廣海，白云峰

(1.解放軍總醫院腫瘤綜合治療科，北京 100853;2.解放軍第302醫院實驗技術保障中心，北京 100039)

原發性肝癌(簡稱肝癌)是由肝細胞或者膽管上皮細胞發生的惡性腫瘤，全世界每年死于肝癌的患者大約26萬人，其中我國占42.5%。由于藥物治療效果欠佳，因此深入闡明肝癌的致病機理對于開發新的藥物治療靶點具有十分重要的意義。磷脂酶 C epsilon(pnospholipase C epsilon，PLCε)為1998年日本神戶大學的片岡徹(Kataoka T)教授［1］在秀麗隱桿線蟲中發現，該研究組還發現PLCε是癌基因產物Ras及抑癌基因產物 Rap的新效應蛋白［2］。2003年Kataoka實驗室采用基因打靶法成功建立了 PLCε敲基因鼠，通過皮膚化學誘癌法(DMBA，TPA 二階段誘癌方案)發現 PLCε－/－小鼠的乳頭瘤發生頻率明顯下降，并且它的惡性進展也被明顯抑制，從而確立了PLCε在皮膚癌變過程中的重要作用［3］，Ikuta 等［4］進一步證明了 TPA 介導PLCε的活化而誘發炎癥，導致腫瘤的形成。本實驗擬采用突變誘發劑二乙基亞硝胺和腫瘤增強劑苯巴比妥誘發 PLCε敲基因型(PLC－/－)和野生型(PLC+/+)小鼠來建立肝臟腫瘤動物模型，以了解PLCε基因敲除鼠的抗癌特性，從而來分析其肝癌的發病機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

PLCε基因敲除鼠采用基因打靶法做成，已對基因敲除鼠進行了形態觀察及分子生物學鑒定，以確認基因缺損鼠喪失PLC活性，由日本引進到解放軍第302醫院動物實驗中心進行實驗研究，隨機選取新生 PLCε－/－(敲基因型)和 PLCε+/+(野生型)雄性小鼠各80只，單鼠體質量6～8 g，動物實驗環境為SPF級，實驗動物使用許可證【SYXK(軍)2007-010】。

1.2 化學致癌劑配制

DEN(淡黃色液體，Sigma公司提供，貨號 N-0258);PB(恒業中遠化工有限公司提供25g/瓶，批號110927)。

1.3 實驗分組及肝癌誘導

將出生后6周小鼠剪尾取血提取DNA，用RTPCR法進行基因型鑒定獲得 PLCε+/+(野生型)，PLCε+/－(雜合子)和 PLCε－/－(敲基因)等三種基因型［5］。選取 PLCε+/+與 PLCε－/－小鼠各 25 對入組，分別進行野生型與野生型、敲基因型與敲基因型自交繁殖，出生后 12日齡時從 PLCε－/－型和PLCε+/+型中隨機選取雄性小鼠各80只，其中:40只 PLCε－/－鼠入實驗組Ⅰ，40 只 PLCε－/－鼠入對照組Ⅰ，40只 PLCε+/+鼠入實驗組Ⅱ，40只 PLCε+/+鼠入對照組Ⅱ。對照組Ⅰ、Ⅱ正常給予飼料及飲水，實驗室溫度控制在20～25℃，濕度控制在40%～70%。實驗組Ⅰ、Ⅱ給予腹腔注射 DEN10μg/(g·bw)［3］，注射后給予正常飼料及飲水，待4周齡后采用濃度為0.05%PB［3］飲水，一周后改為0.06%PB飲水。每天觀察試驗鼠的精神、飲食、毛色、糞便等情況，24周后取肝臟。計算出小鼠的存活率和誘癌成功率，存活率 =每組存活的小鼠數/各組小鼠總數×100%，誘癌成功率=誘癌成功小鼠數/各組小鼠數×100%。

1.4 病理標本的收集和處理

采取脫臼法分別處死實驗組及對照組小鼠，打開腹腔，迅速取出肝臟稱重，觀察肝臟顏色、大小、質地及有無癌變結節。取肉眼觀察到有病變的組織放入4%甲醛溶液中固定24～48 h，再用酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋和切片后進行 HE染色，最后拍照保存。

2 結果

2.1 實驗小鼠的存活數及存活率

實驗期間，由于致癌劑的毒性作用，實驗組小鼠從第3周開始出現精神萎靡，活動和飲食水量減少以及背部出現脫毛等現象，從第5周開始野生型和敲基因型實驗組分別出現死亡，至第24周時野生型實驗組小鼠存活 30只，死亡 10只，存活率為75%，野生型對照組小鼠存活 40只，其存活率為100%;敲基因型實驗組小鼠存活32只，死亡8只，存活率為80%，敲基因型對照組小鼠成活40只，成活率為100%。其具體情況見表1。

2.2 實驗小鼠肝臟肉眼觀察

誘癌24周時，解剖后肉眼觀察，各實驗組小鼠肝臟體積和重量均增大，顏色黯淡，絕大部分表面可見灰白色結節，腫塊大體觀察:切面呈灰白色魚肉狀，無明顯壞死或出血改變，與周圍正常肝組織分界較清晰，其中野生型實驗組小鼠肝臟及腹膜上可見多發小結節狀轉移灶(見圖1，彩插2)。敲基因型實驗組小鼠絕大部分不能肉眼看到肝臟結節，但肝臟體積增大，少部分表面可見灰白色結節。而兩個對照組小鼠的肝臟均呈現光滑無病變(見圖2，彩插2)。

表1 各實驗組小鼠的存活數及存活率分析Tab.1 Number of the mice survived in each experimental group and survival analysis

2.3 實驗小鼠病理分析及誘癌成功率

兩組實驗組病理所見:瘤細胞呈實性巢狀，局灶見壞死，瘤細胞異型性明顯，胞漿豐富，嗜酸性，核圓形，核仁清楚，核分裂像多見。瘤細胞間可見裂隙樣血管，腫瘤與周圍正常肝組織分界較清楚，并可見畸形的瘤巨細胞，部分瘤細胞圍繞血管生長，局部見瘤細胞侵犯血管壁(見圖3和4，彩插2)。野生型實驗組成活的30只小鼠病理分析提示有18只誘發肝癌成功，其誘癌成功率達60%;敲基因型實驗組成活的32只小鼠病理分析提示有15只誘發肝癌成功，其誘癌成功率達46.9%。

3 討論

目前復制腫瘤誘發動物模型的誘發劑種類較多，但大多采用高劑量的致癌劑加促癌物混合短期使用或致癌劑的單獨長期使用的方法來研究腫瘤的形成［6，7］，其誘變是一個比較復雜的多階段作用過程，其促癌物可通過長期反復的累積作用促進潛在的腫瘤細胞發生癌變。DEN具有較強的肝臟毒性作用，其作為致癌物與人原發性肝癌在病因學上存在著一定的相似性，其誘發的小鼠肝癌為肝細胞癌，與人的肝癌的發生過程也較為相似。由于其具有較高的成功率和良好的專一性，DEN誘導肝癌模型迄今仍然是應用最為廣泛的肝癌模型。如壽旗揚等［8］采用小劑量 DEN誘發 C3H/HeN小鼠，成功地建立了肝癌小鼠模型。而侯敏等［9］還利用乙基亞硝脲(ENU)誘變劑也成功地建立了小鼠肺腺癌模型。苯巴比妥(PB)主要是對肝臟作為其特異性靶器官，它有可能抑制正常細胞因其他因素誘導的細胞凋亡，甚至抑制潛在的癌變細胞的細胞凋亡，使病灶中有基因損傷的細胞存活下來，從而促進了腫瘤的形成［10－11］。實驗證明細胞凋亡減少可認為是苯巴比妥重要的促癌途徑之一，苯巴比妥可以通過促進細胞增生和抑制細胞凋亡兩種途徑，來促進癌前細胞增生灶的數量和密度，從而促進腫瘤的形成。事實上，腫瘤的發生正是高細胞增殖率和相對較低的細胞凋亡率共同作用的結果［12］。

PLCε不僅具有 PLC典型的催化結構域(X、Y)、C2結構域同源序列，而且還有特異性的羧基端大鼠肉瘤(rat sarcoma，Ras)相關(ras association，RA)結構域和氨基端 Ras鳥苷交換因子(guanine nucleotide exchange factor，GEF)結構域，研究證明PLCε被小G蛋白激活，可通過對第二信使有直接反應的調節蛋白控制著Ras鳥苷三磷酸酶(GTPase)，因小G蛋白家族成員絕大部分都是癌基因編碼的蛋白，它們在細胞內過度表達或激活與腫瘤的發生發展關系密切，因此推測PLCε在腫瘤的發生發展中起著重要的作用［13］。

本研究采用突變誘發劑(DEN)聯合腫瘤增強劑(PB)成功地誘導出小鼠肝癌動物模型，其天冬氨酸轉氨酶(AST)和丙氨酸轉氨酶(ALT)的生化檢測值比正常PLCε小鼠檢測結果［14］偏高，說明在癌變過程中也會出現炎癥反應。而在誘癌過程中實驗組小鼠出現死亡，而對照組沒有，這可能是由于腹腔注射時的感染、臟器的損傷以及個別小鼠對藥物DEN和PB敏感所造成的。結果顯示PLCε敲基因型實驗組小鼠的成活率高于野生型實驗組，誘癌成功率要低于野生型實驗組，這可能是由于PLCε基因與肝臟腫瘤發生、發展有一定的相關性。該模型是在致癌因子作用下，通過自身細胞的突變、轉化和增殖形成的，這種模型在研究腫瘤的發病機制、組織學和生物學特性以及腫瘤與宿主的相互關系等方面要比移植性肝癌模型更合適更有效［15］。這也為肝臟腫瘤的基因治療提供了一種新的思路和理論依據。

(本文圖 1，2，3，4 見彩插 2 。)

［1］Song C，Hu CD，Masago M，et al.Regulation of a novel human phospholipase C，PLCepsilon，through membrane targeting by Ras.J Biol Chem［J］.2001，276(4):2752 －2757.

［2］Song C，Satoh T，Edamatsu H，et al.Differential roles of Ras and Rap1 in growth factor-dependent activation of phospholipase C epsilon.Oncogene［J］.2002，21(53):8105 － 8113.

［3］Bai Y， Edamatsu H， Maeda S， etal.Crucialrole of phospholipase Cepsilon in chemicalcarcinogen-induced skin tumor development.Cancer Res［J］.2004，64(24):8808－8810.

［4］Shuzo Ikuta，Hironori Edamatsu，Tohru Kataoka，et al.Crucial Role of Phospholipase Cεin Skin Inflammation Induced by Tumor-Promoting Phorbol Ester.Cancer Research［J］.2008，68:64－72.

［5］崔智，李曉娟，白云峰，等.PLCε基因敲除小鼠微衛星 DNA遺傳監測分析［J］.中國比較醫學雜志，2012，22(10):19－23.

［6］丁仕義，蔡金華.大鼠肝細胞癌模型的建立及 MR成像研究［J］.第三軍醫大學學報，2002，24(6):643 － 645.

［7］張閩光，吳孟超，陳 漢，等.TNP-470二乙基亞硝胺誘發大鼠肝癌的作用［J］.腫瘤學雜志，2002，8(1):43－ 45.

［8］壽旗揚，陳方明，趙泓舒，等.二乙基亞硝胺誘發 C3H/HeN小鼠肝癌模型的研究［J］.浙江中醫藥大學學報，2012，36(5):543－546.

［9］侯敏，戴麗軍，譚小軍，等.小鼠肺腺癌模型的建立及腫瘤病理分析［J］.中國實驗動物學報，2012:20(4):75－79.

［10］Tetri S，Ruhanen M，Viitala P，et al.Lack of association between CYP2A5 induction and apoptosis in mouse primary hepatocytes［J］.Biochem Pharmacol，2002，63(3):429 － 435.

［11］Kinoshita A，Wanibuchi H，Imaoka S，et al.Formation of 8－hydroxydeoxyguanosine and cell cycle arrest in the rat liver via generation of ox idative stress by phenobarbital:association with expression profiles of p21(WAF1/Cip1)，cyclin D1 and Ogg1［J］.Carcinogenesis，2002，23(2):341 － 349.

［12］冷言冰，龍冬梅，舒為群，等.苯巴比妥在大鼠肝癌模型中的促癌作用［J］.西北國防醫學雜志，2003，24(5):334 －337.

［13］姜泰茂，楊志軍，白云峰，等.誘發 PLCε基因敲除小鼠膀胱癌發生過程中病變細胞超微結構改變［J］.中國醫科大學學報，2009，38(4):286 －288.

［14］李瑞生，李曉娟，戰大偉，等.PLCε基因敲除小鼠血液生理生化指標分析［J］.實驗動物科學，2012，29(3):1 －4.

［15］金星林，千昌石，杜希臣，等.改良法建立大鼠原發性肝癌變模型與病理形態學研究［J］.中國現代醫學雜志，2009，41(17):189.