不同類(lèi)型土壤和植物對(duì)柴油微生物降解的影響

陸泗進(jìn)，何立環(huán)，孫 聰，彭福利

(中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)總站，北京100012)

加油站地下儲(chǔ)藏罐 (underground storage tanks，USTs)泄漏引起土壤及地下水遭受柴油等油類(lèi)污染物的污染是一個(gè)嚴(yán)重而普遍的環(huán)境問(wèn)題。美國(guó)環(huán)保局對(duì)2001年9月以前的有關(guān)地下油罐污染狀況的數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，全美國(guó)已被確認(rèn)的有滲 (泄)漏問(wèn)題的地下油罐接近42萬(wàn)個(gè)［1］。到2003年仍有14萬(wàn)由于滲 (泄)漏造成污染的地點(diǎn)在等待清理整治［2］。中國(guó)的加油站滲 (泄)漏狀況比美國(guó)要嚴(yán)重得多，雖然尚無(wú)這方面的系統(tǒng)調(diào)查工作，但已是一個(gè)不爭(zhēng)的事實(shí)［3］。這些泄露的柴油等污染物，可輕易進(jìn)入包氣帶土壤，進(jìn)而滲入到地下水系統(tǒng)，污染地下水［4，5］。其具有致癌、致變、致畸等作用，并易于在生物體內(nèi)富集，嚴(yán)重危及人類(lèi)健康和影響生態(tài)平衡。

大量研究表明，在土壤油類(lèi)污染凈化的綜合因素中，微生物降解起著重要作用，很多具有降解特性的菌株也陸續(xù)被分離出來(lái)。如何提高降解菌株在土壤中的數(shù)量和活性，最大程度促進(jìn)降解，成為人們亟待解決的問(wèn)題。但微生物降解污染物往往受到很多環(huán)境因素的影響，如在不同類(lèi)型土壤中，菌株降解污染物能力可能都不盡相同，而且植物根系的生長(zhǎng)以及分泌物都有可能對(duì)微生物的生長(zhǎng)和降解造成一定的影響［6，7］。為此，本研究擬從加油站污染土壤中篩選出對(duì)柴油具較強(qiáng)降解能力的菌株，比較研究在存在植物 (苜蓿和芥菜)情況下，菌株在不同類(lèi)型土壤中對(duì)柴油污染物降解情況。通過(guò)以上研究以期為將來(lái)進(jìn)行加油站汽泄漏油污染現(xiàn)場(chǎng)修復(fù)提供理論參考和新的思路。

1 材料與方法

1.1 菌株的分離與鑒定

污染土壤樣品取至已建站4a的北京市某加油站的儲(chǔ)油罐附近 (2m深)。

采用富集培養(yǎng)的方法分離出一株對(duì)柴油具有較強(qiáng)降解能力的菌株Q18。結(jié)合形態(tài)特征以及生理生化特征分析，初步確定菌株 Q18為紅球菌(Rhodococcus sp．)。

1.2 供試植物

本實(shí)驗(yàn)供試植物采用苜蓿和芥菜。將買(mǎi)至種子站的苜蓿和芥菜的種子放在4℃冰箱中，低溫催化，放置7d后，種子采用10%H2O2浸泡10min，去離子水沖洗，然后用水浸泡催芽。苗床育苗，14d后，從苗床上挖取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，用蒸餾水洗凈根系泥土，供栽培用。

實(shí)驗(yàn)采用250W照明金屬鹵化物燈為植物提供生長(zhǎng)所需的光能，光強(qiáng)為4900μW/cm2，光照長(zhǎng)度為12h/d。

1.3 柴油降解實(shí)驗(yàn)

采用溫室土培的方式進(jìn)行土壤柴油降解實(shí)驗(yàn)。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) (表1)，將需要污染的土盆按5g/kg的油土比加入500mg柴油，充分混勻;然后向需要加入降解菌的土盆中加入25ml菌懸液;最后按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，從苗床上挖取長(zhǎng)勢(shì)一致的植物幼苗，用蒸餾水洗凈根系泥土，移栽到土盆里。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照試驗(yàn)。各實(shí)驗(yàn)均做3次重復(fù)。培養(yǎng)1d、2d、3d、4d和5d后，從土盆中三處不同部位分別取一定量土壤，充分混勻后，取5 g土樣分別測(cè)定土壤中柴油含量。采用Schwab等的方法提取土壤中柴油［8］，含量測(cè)定采用紫外分光光度計(jì)法 (Varian Cary－50 Probe)。

表1 降解實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

考慮到柴油的揮發(fā)性，以及某些非生物降解損失，設(shè)計(jì)了2組空白實(shí)驗(yàn) (表1)。第一組實(shí)驗(yàn)，作為整個(gè)實(shí)驗(yàn)的空白對(duì)照，土壤中除沒(méi)有加入柴油、植物和菌株外，其余條件保持一致。第二組實(shí)驗(yàn)，土壤加入柴油污染，而無(wú)植物和菌株，即除不加菌株和植物外，其余條件保持一致，通過(guò)測(cè)定實(shí)驗(yàn)前后柴油含量的變化得到因揮發(fā)和非生物降解等原因減少的柴油量，然后在各實(shí)驗(yàn)結(jié)果中進(jìn)行相應(yīng)扣除即可消除柴油揮發(fā)、淋失及其它非生物降解等的影響。

為了得到菌株單獨(dú)降解土壤中柴油污染物的能力，設(shè)計(jì)了第三組實(shí)驗(yàn)，即污染土壤，并加入菌株，但沒(méi)有植物;為了考察菌株和植物復(fù)合系統(tǒng)降解柴油的能力，設(shè)計(jì)了第四組實(shí)驗(yàn)，即污染土壤，并加入菌株和植物。具體的降解實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

土培試驗(yàn)采用的土壤取至無(wú)油類(lèi)污染場(chǎng)地，土樣室溫下風(fēng)干后，過(guò)2mm的篩，然后將土樣分2次在120℃下加熱30min進(jìn)行滅菌。土壤的基本性質(zhì)見(jiàn)表2。

表2 土培降解實(shí)驗(yàn)土壤的基本性質(zhì)

2 結(jié)果與討論

2.1 砂壤土中的柴油降解

實(shí)驗(yàn)中的溫度、pH和土壤含水量分別控制為30℃、6.0和30%。在此條件下，菌株和植物均生長(zhǎng)良好。

菌株Q18以及菌株與植物苜蓿、芥菜的復(fù)合體系在砂壤土中，培養(yǎng)一定時(shí)間后，剩余柴油的濃度列于表3。

表3 降解后剩余柴油的濃度 (平均值±方差) (g/kg)

由表3可以看出，隨時(shí)間的增加，土壤中殘留的柴油濃度逐漸減少，即降解的柴油量逐漸增加。很容易計(jì)算出，菌株Q18、菌株Q18－苜蓿以及菌株Q18－芥菜復(fù)合體系5d內(nèi)柴油總的降解率依次為46.28%、63.55%和69.18%。可見(jiàn)，菌株Q18對(duì)土壤中柴油污染物具有較強(qiáng)的降解能力，而且菌株Q18復(fù)合植物苜蓿和芥菜后，柴油降解率大大提高。其降解能力順序?yàn)?菌株Q18－芥菜＞菌株Q18－苜蓿＞菌株Q18。

在不同的時(shí)間段內(nèi)，柴油的降解率也很容易計(jì)算出，其結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，在砂壤土中，隨時(shí)間的增加，菌株Q18對(duì)柴油的降解率先依次增大后逐漸減少，在3d時(shí)降解率達(dá)到最大(9.50%)。這說(shuō)明，菌株投入土壤后，可能需要一定的時(shí)間來(lái)適應(yīng)土壤環(huán)境條件，隨著對(duì)土壤環(huán)境的適應(yīng)，菌株開(kāi)始逐漸增殖、擴(kuò)散，數(shù)量及活性增加，導(dǎo)致降解率提高，但隨著菌株的成熟和衰老，菌株數(shù)量及活性又會(huì)下降，這樣降解率也會(huì)逐漸降低。因此，曲線整體呈現(xiàn)鐘形。菌株與植物的復(fù)合體系對(duì)柴油的降解率隨時(shí)間的變化關(guān)系也與此基本類(lèi)似。不過(guò)曲線上升更快，下降也更為平緩。這表明，植物苜蓿和芥菜的存在可能對(duì)菌株Q18的數(shù)量和活性有較大的影響。

另外，由圖1也可以看出，在每個(gè)時(shí)間段菌株Q18和芥菜的復(fù)合體系對(duì)柴油的降解率都最大，其次為菌株Q18和苜蓿的復(fù)合體系，菌株Q18最小。這說(shuō)明，不論芥菜還是苜蓿與菌株Q18復(fù)合，都能有效提高柴油的降解，且菌株Q18和芥菜的復(fù)合體系降解柴油能力更強(qiáng)。

在預(yù)備實(shí)驗(yàn)中，研究了植物芥菜和苜蓿單獨(dú)對(duì)土壤中柴油的降解能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)條件下，種植植物芥菜和苜蓿前后 (5d)，土壤中柴油的濃度基本沒(méi)有變化，即植物芥菜和苜蓿對(duì)柴油可能基本沒(méi)有降解能力。這說(shuō)明，柴油主要還是被菌株Q18所降解，苜蓿和芥菜可能主要起到強(qiáng)化菌株Q18降解柴油的作用。菌株與植物復(fù)合體系之所以能提高降解率，主要原因可能是植物和菌株間的相互作用。可能由于植物的存在，提高了菌株Q18的數(shù)量和活性，強(qiáng)化了降解。由于植物芥菜和苜蓿都具有較為發(fā)達(dá)的根系，且能深入土壤，表面積也較大，在其生長(zhǎng)過(guò)程中，根系疏松了土壤，使土壤更為通氣，還可能分散了柴油。此外，根系的分泌物不僅能為菌株提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從而活化菌株，還可能與柴油螯合而活化柴油，促進(jìn)了降解的發(fā)生。因此，植物的存在及根系的生長(zhǎng)可能改變了土壤環(huán)境，使其更適宜菌株的生長(zhǎng)和降解，在這些因素的綜合作用下導(dǎo)致菌株Q18數(shù)量和活性的提高，促進(jìn)了柴油污染物的降解。

2.2 砂土和粘土中柴油的降解

為了考察不同類(lèi)型土壤對(duì)菌株降解柴油的影響，實(shí)驗(yàn)研究了在砂土和粘土中，菌株Q18及菌株植物復(fù)合體系對(duì)柴油的降解情況。實(shí)驗(yàn)條件均與上述實(shí)驗(yàn)一致。

菌株對(duì)柴油的降解率隨時(shí)間的關(guān)系如圖2和圖3。

由圖2、圖3可以看出，在砂土和粘土中，柴油的降解率也是隨時(shí)間增加先依次增大而后逐漸減少，在3d時(shí)降解率最大，降解能力大小順序也是菌株Q18和植物的復(fù)合體系大于菌株Q18，這也與圖1變化趨勢(shì)基本類(lèi)似。不過(guò)，曲線增長(zhǎng)和下降幅度不盡相同，而且在砂土中，菌株Q18與苜蓿復(fù)合體降解柴油能力最強(qiáng);在粘土中，則是菌株Q18與芥菜復(fù)合體降解柴油能力最強(qiáng)。這說(shuō)明，不同的土壤類(lèi)型對(duì)于菌株Q18及菌株植物復(fù)合體系降解柴油具有明顯的影響，但不管在哪種類(lèi)型土壤中，植物活化作用都是顯著存在的。只是，植物強(qiáng)化菌株降解柴油的能力可能在不同類(lèi)型土壤中并不相同。

表4列出了菌株Q18、菌株Q18與苜蓿已及菌株Q18與芥菜復(fù)合體系在3種不同類(lèi)型土壤中5d內(nèi)總的降解率。

表4 不同類(lèi)型土壤中5d內(nèi)柴油總降解率 (%)

由表4可以清楚看出，5d內(nèi)，菌株Q18對(duì)柴油的降解率在砂壤土中最高，達(dá)到46.28%，其次為砂土，在粘土中降解率最低，大小順序?yàn)樯叭劳粒旧巴粒菊惩痢＞闝18與芥菜復(fù)合體系對(duì)柴油降解也表現(xiàn)出同樣的規(guī)律，對(duì)柴油的降解率也是在砂壤土中最高 (69.17%)，然后依次為砂土，粘土。但是菌株Q18與苜蓿復(fù)合體系則不同，其對(duì)柴油的降解率是在砂土中最高，達(dá)到65．05%，其次為砂壤土，粘土中最低。可見(jiàn)，不同的土壤類(lèi)型，對(duì)柴油的降解是有顯著影響的，而且在不同類(lèi)型的土壤中，植物苜蓿和芥菜強(qiáng)化菌株Q18降解柴油的能力也是不同的。在砂土中，苜蓿強(qiáng)化菌株Q18降解柴油的能力強(qiáng)于芥菜;在砂壤土和黏土中，芥菜強(qiáng)化菌株Q18降解柴油的能力強(qiáng)于苜蓿。由于苜蓿和芥菜生長(zhǎng)的差異，根際環(huán)境也不同，因此可能是植物不同的生長(zhǎng)特性導(dǎo)致了苜蓿和芥菜活化菌株Q18的差異，造成了降解柴油的能力的差異。

另外，在粘土中，菌株以及菌株植物的復(fù)合體系對(duì)柴油降解率普遍都低于在砂土和砂壤土中的降解率。原因可能是由于砂土及砂壤土具有良好的孔隙度，通透性好，表面積也較大，適宜菌株和植物生長(zhǎng)，而孔隙小、易板結(jié)的粘土環(huán)境可能并不適宜于菌株及植物的生長(zhǎng)的緣故。

總體而言，在不同類(lèi)型土壤中，植物苜蓿和芥菜都表現(xiàn)出很強(qiáng)的強(qiáng)化菌株降解柴油的能力。在本實(shí)驗(yàn)條件下，菌株Q18與芥菜復(fù)合體系在砂壤土中降解柴油能力最強(qiáng)，菌株Q18與苜蓿復(fù)合體在砂土中降解柴油能力次之。

總之，不同類(lèi)型的土壤對(duì)柴油微生物降解的影響顯著，這對(duì)于今后開(kāi)展油污染土壤現(xiàn)場(chǎng)修復(fù)具有重要意義。同時(shí)，復(fù)合植物條件下的微生物降解也為污染土壤修復(fù)提供了新的思路。

3 結(jié)論

(1)菌株Q18對(duì)土壤中柴油具有較強(qiáng)的降解能力，而且植物苜蓿和芥菜都能顯著強(qiáng)化菌株Q18對(duì)柴油的降解。

(2)不同的土壤類(lèi)型，能影響菌株Q18對(duì)柴油的降解，菌株Q18對(duì)柴油的降解率在砂壤土中最高，達(dá)到46.28%，其次為砂土，在粘土中降解率最低。

(3)植物苜蓿和芥菜強(qiáng)化菌株Q18降解柴油的能力也受不同土壤類(lèi)型的影響，在砂土中，苜蓿強(qiáng)化菌株Q18降解柴油的能力強(qiáng)于芥菜;而在砂壤土和粘土中，芥菜強(qiáng)化菌株Q18降解柴油的能力強(qiáng)于苜蓿。總體而言，菌株Q18與芥菜復(fù)合體在砂壤土中降解柴油能力最強(qiáng)，菌株Q18與苜蓿復(fù)合體在砂土中降解柴油能力次之。

［1］ US Environmental Protection Agency．Cleaning Up Underground Storage Tank System Releases［EB/OL］．http://www．epa．gov/swerustl/cat/，2005．

［2］ Cliff Rothenstein．FY 2003 Semi－Annual End－of－Year Activity Report．Office of Underground Storage Tanks ［J］．US Environmental Protection Agency，2003．

［3］薛健．加油站污染與防治［J］．黑龍江環(huán)境通報(bào)，2003，27(4):27－28．

［4］ Pelletiera E，Delilleb D，Delilleb B．Crude oil bioremediation in sub－Antarcticintertidal sediments:chemistry and toxicity of oiled residues［J］．Marine Environmental Research，2004， (57):311－327．

［5］ Wong J W C，F(xiàn)ang M，Zhao Z．et al．Effect of surfactants on solubilization and degradation of phenanthrene under thermophilic conditions［J］．Journal of Environmental Quality，2004， (33):2015－2025．

［6］ Sorkhoh N A，Ibrahim A S，Ghannoum M A，et al．High temperature hydrocarbon degradation by Bacillus stearothermophilus from oil－polluted Kuwait desert［J］．Applied Microbiology and Biotechnology，1993，(39):123－126．

［7］ Ijah U J J，Antai S P．Removal of Nigerian light crude oil in soil over a 12－month period［J］．International Biodeterioration＆ Biodegradation，2003，(51):93－99．

［8］ Schwab A P，Su J，Eetzel S，Pekarek et al．Extraction of petroleum hydrocarbons from soils by mechanicial shaking．Environmental［J］．Science and Technology，1999，(33):1940－1945．

［9］周啟星，宋玉芳．污染土壤修復(fù)原理與方法［M］．北京:科學(xué)出版社，2004．

［10］ Samanta S K，Singh O V，Jain R K．Polycyclic aromatic hydrocarbons:environmental pollution and bioremediation［J］．Trends in Biotechnology，2002，(20):243－248 ．

［11］ Alvarez P J，Vogel T M．Substrate Interactions of benzene，toluene，and para－xylene during microbial degradation by pure cultures and mixed culture aquifer slurries ［J］．Appl Environ Micro-biol，1991，57(10):2981 －2985．

［12］ Fayolle F，Hernandez G．Le Roux F，et al．Isolation of two aerobic bacterial strains that degrade efficiently ethyl t－butyl ether(ETBE)［J］．Biotechnol Letts，1998，(20):283－286．