人胚腎293細胞中乙酰轉移酶p300對二甲基精氨酸二甲胺水解酶2基因表達的調節*

李英慧，李家亓，孫陸，初國銘，孫志軍

一氧化氮(NO)具有舒張血管、抗血小板黏附與聚集等功能，同時它在腎單位的不同部位發揮促進尿鈉排泄的作用［1-6］，腎臟的一氧化氮生物效應降低是高血壓的重要特征之一［7］。一氧化氮由三種一氧化氮合酶(NOS)催化合成，包括:神經型(nNOS)、誘導型(iNOS)和內皮型(eNOS)。非對稱性二甲基精氨酸(ADMA)是三種一氧化氮合酶的共同內源性抑制劑，在體內ADMA主要由二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)降解。多種心血管危險因素可通過降低DDAH活性影響一氧化氮合酶和一氧化氮作用，從而參與高血壓發生和發展［8-10］。因此，NOS和DDAH/ADMA系統是調節組織一氧化氮水平從而參與血壓調節的兩個重要方面。DDAH分為兩種亞型(DDAH1和DDAH2)，DDAH2在調節ADMA代謝中發揮更為重要的作用。

乙?；瘏⑴c調節多種基因表達，p300是一種重要的乙酰轉移酶。我們的研究及其他報道顯示，p300介導的乙?；瘏⑴c三種一氧化氮合酶基因的表達調控［11，12］，迄今為止尚少見有關乙?；瘜?DDAH基因表達調節的報道，本研究旨在探討p300是否亦參與調節DDAH2基因的表達。我們以人胚腎HEK293細胞為研究對象，通過轉染野生型及乙酰轉移酶(HAT)結構域缺失的突變型p300表達載體，檢測DDAH2基因表達水平及啟動子活性變化，從而探討人胚腎HEK293細胞中乙?；瘜DAH2表達的調控作用。

1 材料和方法

細胞培養及轉染:實驗時間:2010-03至2011-06選取人胚腎HEK293細胞(來自中國科學院上海生命科學研究院)在DMEM培養基(含10%的胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素，美國 GIBCO 公司)、37℃、5%CO2及飽和濕度的條件下培養。0.25%的胰酶(生理鹽水配制)消化傳代。轉染前將培養基更換為無血清無抗生素培養基，應用 LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)轉染試劑轉染野生型或乙酰轉移酶(HAT)結構域缺失的突變型p300 表達載體(Margottin-Goguet教授惠贈［13］)，6 h 后更換為常規培養基培養細胞待用。

Western blot雜交:單去污裂解液方法提取細胞總蛋白，煮沸后上樣至十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，電轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，室溫封閉。分別以1∶1000稀釋的兔p300或β-肌動蛋白(βactin)多克隆抗體(購自美國Santa Cruz公司)為一抗進行雜交過夜，洗膜后加入1∶3000稀釋的山羊抗兔IgG作為二抗，室溫雜交2 h。化學發光法檢測雜交信號。

實時定量聚合酶鏈式反應(real-time PCR):TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)常規方法提取細胞核糖核酸(RNA)，應用DNAase I消化殘留 DNA，使用美國Promega公司反轉錄試劑盒應用隨機引物法合成編碼脫氧核糖核酸(cDNA)。應用 SYBR Green(日本TaKaRa公司)染料法，以β-actin為內參，采用相對定量方法進行real-time聚合酶鏈式反應(PCR)擴增。DDAH2特異性引物序列為:上游5'-TCCCTTCTCCACCAACTCTG-3'，下游 5'-CAACCGCTCGGATTTCTTAG-3';β-actin特異性引物序列為:上游5'-CCCAGAGCAAGAGAGGCA-3'，下游 5'-GGGAGCCACACGCAG-3'。在優化條件下應用AB公司7500型熒光定量PCR儀進行real-time PCR擴增，每個樣品重復擴增三次，每次設置三復孔，取平均值作為相對表達量。

DDAH2動子結構分析及載體構建:應用TRANSFAC-TESS及 Alibaba軟件分析 DDAH2啟動子區593bp(－530～+63)序列，預測其中是否存在受乙?；{控的轉錄因子結合位點。確定轉錄起始位點為+1，將+44～+63定為下游引物，上游引物分別于－530～－510，－171～151處，以人基因組DNA為模板，不同的PCR反應條件下進行擴增，膠回收純化后，將片段克隆至pMD18-T克隆載體，酶切鑒定。使用HindIII和KpnI雙酶切所得載體及熒光素酶報告基因載體pGL3-Basic(美國Promega公司)，應用T4 DNA連接酶將酶切獲得的不同長度DDAH2啟動子序列連接于pGL3-Basic載體上，進行測序鑒定。所得載體分別命名為pGL530w和pGL171w應用美國Axygen公司質粒小量提取試劑盒提取質粒。

熒光素酶報告基因活性檢測:24孔培養皿中接種 HEK293 細 胞，37℃ 培 養 24 h，應用LipofectamineTM2000將pGL530w DNA或pGL171w DNA及對照pRL-TK質粒DNA(美國Promega公司)轉染至細胞，同時共轉染野生型或突變型p300表達載體。應用Promega公司DUAL-GLOTM雙熒光素酶檢測系統檢測啟動子活性，將pGL530w或pGL171w與pRL-TK活性比值作為啟動子相對活性。每個樣品重復三次，取平均值。

統計分析:使用SPSS 13.0統計軟件，應用t檢驗判斷組間差異，以確定組間差異是否具有顯著性。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

p300對DDAH2 mRNA表達水平的影響:①應用Western blot鑒定轉染效果，結果如圖1所示，轉染野生型和突變型p300表達載體的細胞中p300蛋白表達水平顯著提高(P＜0.05)。②應用real-time PCR方法檢測了p300對DDAH2 mRNA表達水平的影響，結果顯示野生型p300可顯著提高DDAH2 mRNA表達，與對照比較差異有統計學意義(P＜0.05)，而轉染HAT結構域缺失的突變型p300載體的細胞中DDAH2 mRNA表達，與對照比較差異無統計學意義(P＞0.05)(圖2)。

DDAH2啟動子熒光素酶基因報告基因載體的構建:為鑒定DDAH2啟動子活性，首先應用TRANSFACTESS及Alibaba軟件分析了DDAH2啟動子結構，發現其中存在多種潛在的受乙酰化調控的轉錄因子結合位點，如核因子-κB(NF-κB)、CCAAT/增強子結合蛋白(C/EBP)、特異性蛋白1(Sp1)等。

根據預測到的反應元件的位置，我們構建了兩個DDAH2啟動子熒光素酶報告基因載體，分別包含DDAH2啟動子－530～+63及－171～+63區域，命名為pGL530w和pGL171w(二者結構如圖3所示)，并經測序鑒定。

p300對DDAH2啟動子活性的作用:應用雙熒光素酶檢測系統，我們分析了DDAH2啟動子活性。結果顯示，基礎條件下，pGL530w和pGL171w均存在較高的活性，轉染野生型p300表達載體可顯著提高二者活性，與對照(未處理細胞)相比差異有統計學意義(P＜0.05)，但突變型p300對二者活性的作用與對照比較差異無統計學意義(P＞0.05)(圖4)。

圖1 Western blot結果顯示表達載體轉染后p300蛋白表達情況。β-actin:β-肌動蛋白 wt-p300:轉染野生型 p300表達載體;mut-p300:轉染突變型p300表達載體 對照:未處理細胞

圖2 實時定量聚合酶鏈式反應(real-time PCR)結果顯示不同條件下DDAH2 mRNA表達水平。與對照(未處理細胞)比較*P＜0.05。圖示三次實驗均值±標準差;△:以 DDAH2與β-actin mRNA表達量比值作為DDAH2 mRNA相對表達量，每個樣品重復擴增三次，每次設置三復孔，取平均值。DDAH2:二甲基精氨酸二甲胺水解酶，余注見圖1

圖3 兩個DDAH2啟動子熒光素酶報告基因載體結構示意圖

圖4 熒光素酶結果顯示不同條件下DDAH2啟動子活性。與對照(未處理細胞)比較*P＜0.05。圖示三次實驗均值±標準差。△:將pGL530w或pGL171w與pRL-TK活性比值作為相對熒光素酶活性，每個樣品重復三次，取平均值，余注見圖1

3 討論

蛋白質乙?；且环N生物體內廣泛存在的表觀遺傳學修飾。多種蛋白質(主要包括組蛋白和轉錄因子)可進行乙酰化修飾，它們在轉錄水平調節基因表達。蛋白質的乙?；街饕軆深惷傅恼{節，即組蛋白HAT和組蛋白去乙?；?HDAC)。HAT將乙酰輔酶A的乙酰基團轉移至蛋白質特定賴氨酸殘基而引起蛋白質乙酰化，HDAC與其作用相反。目前已發現多種高血壓相關基因受乙酰化的調節，例如WNK4(一種鈉離子重吸收的調節因子)基因是一種重要的高血壓候選基因，研究顯示刺激β(2)腎上腺素受體可導致腎臟中AMP依賴的組蛋白去乙?；?(HDAC8)活性的抑制，而引起組蛋白乙?；?，增強糖皮質激素受體與WNK4啟動子的一個負性糖皮質激素受體反應元件結合，導致WNK4表達抑制，其可能在鹽敏感性高血壓發生中具有重要意義［14］。同時有研究顯示乙?；谏窠浵到y對血壓的調節中亦有重要意義，例如褪黑素在神經膠質細胞及神經干細胞中可引起組蛋白乙酰化，從而調節多種基因的表達，而腦干中血管舒張調節區表達高水平的褪黑素受體［15］。因此，乙酰化已被認為是一種重要的潛在的高血壓治療靶點。

一些轉錄輔激活因子已被證實具有乙酰轉移酶的活性，包括 p300、PCAF、GCN5 等［16，17］。p300 是研究的最為深入的具有乙酰轉移酶活性的輔激活因子之一，它是一種具有多個重要結構域的大分子蛋白質，其中包括一個重要的HAT結構域，它可以催化所有四種核心組蛋白N末端的賴氨酸殘基和許多其他非組蛋白的乙酰化，并且這種乙?；δ軐300在一些基因中的轉錄激活功能是必需的［18］。例如與野生型p300相比，HAT功能域缺失的p300不能使iNOS基因表達上調［10］。因此，為鑒定乙?；瘜DAH2基因表達的影響，我們分別轉染了野生型及HAT結構域缺失的突變型p300表達載體，real-time PCR結果顯示野生型p300顯著上調DDAH2 mRNA表達水平，而突變型p300無此作用，提示p300對DDAH2的表達上調依賴于HAT結構域，說明p300可能通過乙?；承┑鞍踪|而上調DDAH2 mRNA水平。同時我們注意到突變型p300可使DDAH2 mRNA水平輕度下調，這可能是由于外源的突變型p300競爭性抑制了內源性p300與某些轉錄相關蛋白的結合及其乙酰轉移酶的功能，而影響了DDAH2的轉錄。

同時，為進一步鑒定乙?；{節DDAH2表達的機制，我們應用軟件分析了DDAH2啟動子結構，結果發現啟動子區存在多種受乙?；{節的轉錄因子結合位點，包括 NF-κB、Sp1、C/EBP 等，提示 p300 可能通過乙?；@些轉錄因子及組蛋白，而影響啟動子活性，從而調節DDAH2基因表達。因此我們構建了兩個DDAH2啟動子熒光素酶報告基因載體，與p300表達載體共轉染HEK293細胞后，檢測熒光素酶活性。結果顯示，野生型p300可顯著上調啟動子活性，而缺失HAT結構域的p300作用不明顯，提示p300對DDAH2啟動子的作用依賴于其HAT結構域，提示它通過調節蛋白質的乙酰化而調節啟動子活性，進一步說明了乙?；贒DAH2基因表達調控中的作用。

綜上，我們的結果顯示腎臟細胞中p300介導的乙?；赏ㄟ^調節DDAH2基因啟動子活性，從而參與調節DDAH2基因表達。我們的結果及從前的報道證明p300—乙?；緩酵瑫r調節NOS及DDAH/ADMA系統，因此其可能在組織NO生物合成種發揮重要作用，從而參與調節血壓水平，這有可能為尋找新的高血壓發生的分子機制提供一定的理論基礎，并為其治療提供新的分子靶標。

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