冠心病候選基因β2腎上腺素能受體基因相關(guān)微小核糖核酸let-7i的實(shí)驗研究

郭威早，李琳

β2腎上腺素能受體基因［人類基因組織(HUGO)命名委員會(HGNC)標(biāo)準(zhǔn)全名:“adrenergic，beta-2-，receptor，surface”，HGNC 標(biāo)準(zhǔn)基因代號:ADRB2］，是冠心病的重要候選基因，與重型進(jìn)行性冠心病，例如伴有急性心肌梗死的冠心病關(guān)系尤為密切［1］。該基因的蛋白產(chǎn)物屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，通過G蛋白作用介導(dǎo)兒茶酚胺誘導(dǎo)的腺苷酸環(huán)化酶活化。在結(jié)構(gòu)方面，該基因非常特殊，同絕大多數(shù)結(jié)構(gòu)基因不同，該基因沒有內(nèi)含子，因此該基因在表達(dá)調(diào)控方面可能具備區(qū)別于大多數(shù)基因的特點(diǎn)。此外，該基因的5’側(cè)翼序列中含有糖皮質(zhì)激素反應(yīng)基序(glucocorticoid response element，GRE)［2］，而糖皮質(zhì)激素與應(yīng)激及心功能關(guān)系極為密切［3］。因此該基因具有GRE的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，有助于合理地解釋冠心病與應(yīng)激的密切關(guān)系［4］。微小核糖核酸(microRNA，簡稱miRNA)是生物體中內(nèi)源性的，由基因表達(dá)產(chǎn)生的RNA分子，其最終的活性形式為短鏈RNA分子，長度為22核苷酸左右，通過與相關(guān)的信使RNA結(jié)合抑制其翻譯或誘發(fā)其降解。miRNA通過基因調(diào)控，在細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化以及對環(huán)境的適應(yīng)中發(fā)揮著非常重要的作用［5］。探討miRNA調(diào)控機(jī)制與ADRB2的基因功能的關(guān)系，可以更深入地認(rèn)識ADRB2的基因調(diào)控機(jī)制，亦可以促進(jìn)對冠心病的分子病理學(xué)的認(rèn)識，為探索新的預(yù)防和治療途徑提供分子水平的新線索。

1 資料與方法

調(diào)節(jié)ADRB2基因候選miRNA的預(yù)測:miRNA機(jī)制是一類特殊的基因調(diào)控機(jī)制，miRNA和被調(diào)控基因之間沒有特定的、嚴(yán)格的對應(yīng)關(guān)系，具有“一對多、多對一”的特點(diǎn)，復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)模式使直接的實(shí)驗驗證難度很高、成本巨大。因此，對調(diào)節(jié)特定基因的miRNA進(jìn)行預(yù)測具有重要的實(shí)用意義。基于上述原因，學(xué)界對miRNA與靶位點(diǎn)之間的模糊匹配關(guān)系進(jìn)行了大量深入的研究，建立了行之有效的預(yù)測模型。本研究所采用的預(yù)測方法就是依據(jù)既往研究所發(fā)現(xiàn)的一種組合策略［6］，這一策略認(rèn)為，如果以下二個條件滿足，則相關(guān)miRNA和基因之間就具備調(diào)控和被調(diào)控關(guān)系:①從miRNA 5’端第一或第二堿基算起的7個連續(xù)堿基的“核”序列或“種子”序列與被調(diào)節(jié)基因3’端非轉(zhuǎn)錄區(qū)(UTR)部分序列構(gòu)成完全Watson-Crick匹配(即符合堿基配對原則的匹配);②上述“核”序列和3’-UTR對應(yīng)序列之間可以具有不匹配的堿基，只要二者結(jié)合的自由能不增加并且不含G∶U配對。此策略簡稱為“種子區(qū)”(seed-region)預(yù)測法，按種子區(qū)法，利用美國麻省理工學(xué)院(MIT)TargetScan數(shù)據(jù)庫(2011-11第6版)，對人ADRB2基因561bp(根據(jù)NCBI編號為NM_000024的參考序列)的3’-UTR進(jìn)行了候選miRNA的預(yù)測。

心肌細(xì)胞株培養(yǎng):實(shí)驗研究于2011-09至2012-04之間進(jìn)行。大鼠心肌細(xì)胞株H9c2(2-1)按照既往報道的方法［7］進(jìn)行培養(yǎng)。基本步驟為，采用DMEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清，在5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)。一輪培養(yǎng)3天，然后按1∶4的比例分盤繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞脫壁收集采用0.25%胰蛋白酶合并0.53 mM依地酸二鈉(EDTA)溶液處理10 min。

miRNA的增強(qiáng)和抑制:Pre-miR miRNA前體(增強(qiáng)劑)和Anti-miR miRNA抑制劑及相應(yīng)對照均從美國Ambion公司購買。根據(jù)相應(yīng)miRNA序列的隨機(jī)化紊亂(scramble)序列所合成的短鏈RNA作為陰性對照。采用美國Neuromics公司iFect轉(zhuǎn)染試劑盒，將let-7i增強(qiáng)劑(n=6)、抑制劑(n=6)及miRNA陰性對照(n=6)分別導(dǎo)入培養(yǎng)的H9c2(2-1)大鼠心肌細(xì)胞，具體操作按照該試劑盒說明書進(jìn)行。每種miRNA轉(zhuǎn)染劑量在前期預(yù)實(shí)驗的基礎(chǔ)上，正式實(shí)驗劑量選擇為20 nmol/L。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后狀態(tài)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

蛋白免疫印跡雜交:蛋白免疫印跡雜交(Western Blot)參照文獻(xiàn)報道［7］方法進(jìn)行，作了少許簡化和適應(yīng)性修改。具體步驟簡述如下，將所收集的約106心肌細(xì)胞重懸于1ml冰冷的裂解緩沖液，勻漿后通過Virtis超聲細(xì)胞粉碎儀進(jìn)行超聲剪切，繼以14000g離心5 min去除不溶性沉渣。蛋白濃度測定采用Pierce公司BCA蛋白試劑盒進(jìn)行。等量的蛋白加入到8% ～16%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離，然后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。硝酸纖維素膜上的非特異結(jié)合通過以下雜交液屏蔽。雜交液包括Tris緩沖鹽水，0.1%吐溫-20?，5%脫脂牛奶。兔抗人 ADRB2抗體購自美國Santa-Cruz生物技術(shù)公司，該抗體除可用于人源性ADRB2蛋白的檢測，亦可以用于大鼠ADRB2蛋白的檢測。實(shí)驗中采用1∶200的比例稀釋。β-肌動蛋白抗體(美國Cell Signaling公司)用作上樣對照。次級抗體為辣根過氧化物酶耦聯(lián)的抗兔抗體。免疫復(fù)合物用Amersham ECL加強(qiáng)型試劑盒探測。免疫印跡的定量分析采用Syngene凝膠建檔及分析系統(tǒng)進(jìn)行。

統(tǒng)計分析:一元ANOVA采用SPSS 11.5版進(jìn)行。資料收集，一般統(tǒng)計計算(均值±標(biāo)準(zhǔn)差等)以及統(tǒng)計作圖采用GraphPad Prism(第4版)進(jìn)行。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

miRNA let-7家族與ADRB2基因關(guān)系:根據(jù)預(yù)測結(jié)果，約有150個 miRNA具有不同程度的調(diào)節(jié)人ADRB2基因的可能性。表1列舉了種子區(qū)完全配對的ADRB2基因候選miRNA。

表1 種子區(qū)完全配對的β2腎上腺素能受體基因候選微小核糖核酸

其中4個miRNA家族具有種系穩(wěn)定性(conservation)［8］:靈長類、嚙齒類等動物之間具有高度一致的同源性。該4個miRNA家族中11個miRNA成員按照種子區(qū)原理與ADRB2具有很好的匹配性，無論從5’端的第一個或第二個堿基開始，均表現(xiàn)為其后7個堿基的完全Watson-Crick配對，也就是5’端開始的8個堿基的完全配對，符合種子區(qū)挑選法的最高要求。4個 miRNA 家族為 miRNA-98、miRNA-4458、miRNA-4500和let-7，其中l(wèi)et-7家族與 ADRB2關(guān)系特別明顯，let-7家族的 8個成員，let-7a/b/c/d/e/f/g/i，都對ADRB2基因具有理論預(yù)測的調(diào)控作用。根據(jù)已知的研究資料，在let-7家族內(nèi)部，let-7i和冠心病關(guān)系密切［9］，因此，被挑選作為進(jìn)一步實(shí)驗驗證對象。

let-7i功能水平與ADRB2基因蛋白表達(dá)水平:用let-7i的Pre-miRNA前體和let-7i的Anti-miRNA分別對培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞株H9c2(2-1)實(shí)施轉(zhuǎn)染，然后處理48 h.let-7i的原序列為5’-UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGU-3’，采用美國麻薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院的在線程序?qū)嵤┪蓙y化處理，得到的序列為5’-GAUGGGGCUUAGUUUUGUGUA-3’，作為實(shí)驗的 miRNA陰性對照。大鼠心肌細(xì)胞在增強(qiáng)和抑制處理后，組織形態(tài)學(xué)無明顯變化，根據(jù)倒置顯微鏡觀察計數(shù)，let-7i增強(qiáng)劑作用的細(xì)胞計數(shù)比miRNA陰性對照高8% ～11%，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，圖1)。

圖1 經(jīng)let-7i Pre-miRNA前體和let-7i Anti-miRNA抑制劑處理的大鼠心肌細(xì)胞

let-7i功能水平與ADRB2基因蛋白表達(dá)水平相關(guān)關(guān)系:使用 let-7i Pre-miRNA(增強(qiáng)劑)處理細(xì)胞48h后，ADRB2基因蛋白表達(dá)水平降低，以光密度(OD)所表示的蛋白水平由 miRNA陰性對照水平67.03±15.20下降至 25.59±10.53，下降了 61.83%(P=0.0012，95%可信區(qū)間:19.22～63.66);與 let-7i增強(qiáng)劑處理效果相反，當(dāng)使用let-7i Anti-miRNA(抑制劑)處理細(xì)胞48 h后，ADRB2基因蛋白表達(dá)水平由miRNA陰性對照水平上升至99.53±25.23，升高了48.49%(P=0.0071，95% 可 信 區(qū) 間:－54.72～－10.28)，let-7i功能水平與ADRB2基因蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，見圖2。

圖2 let-7i增強(qiáng)劑和let-7i抑制劑對ADRB2蛋白質(zhì)水平的影響。大鼠心肌細(xì)胞株H9c2(2-1)分別以let-7i增強(qiáng)劑和let-7i抑制劑轉(zhuǎn)染處理48 h，ADRB2蛋白水平以免疫印跡雜交確定。圖中蛋白水平為miRNA陰性對照水平的百分比(miRNA陰性對照水平設(shè)定為100%)，β-肌動蛋白(ACTB)抗體作為電泳上樣內(nèi)參照。圖示的數(shù)據(jù)為均值±標(biāo)準(zhǔn)差，每組6個樣本(n=6)，與miRNA陰性對照比較＊＊P＜0.01，統(tǒng)計檢驗采用方差分析

3 討論

冠心病作為復(fù)雜性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚無定論，但一般認(rèn)為是遺傳易感性和環(huán)境相互作用的結(jié)果［10］。在遺傳易感性方面，研究主要聚焦于一些與冠心病發(fā)病密切相關(guān)的候選基因方面，例如ADRB2;在環(huán)境方面，應(yīng)激因素歷來是被關(guān)注的重點(diǎn)［11］。miRNA與上述二個方面都有極為密切的關(guān)系。首先，miRNA是近年來才發(fā)現(xiàn)的基因調(diào)控的重要機(jī)制，miRNA以特定的方式在轉(zhuǎn)錄后和翻譯前調(diào)節(jié)眾多基因的表達(dá)水平。此外，miRNA是機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)中最重要的基因調(diào)控機(jī)制之一［12］。將上述二個方面聯(lián)系起來，miRNA和冠心病之間存在聯(lián)系具有極高的可能性。

本研究以冠心病一個重要候選基因ADRB2為基礎(chǔ)，預(yù)測了可能調(diào)節(jié)該基因的miRNA。在調(diào)節(jié)ADRB2的多個miRNA家族中，let-7家族值得特別關(guān)注。首先，let-7家族具有廣泛的種系穩(wěn)定性或稱為保守性，說明其在基因調(diào)控中具有基礎(chǔ)級的重要作用。另外，本文作者自己和其他研究者的工作均提示，let-7家族與心血管病關(guān)系密切。第一點(diǎn)表現(xiàn)在間接關(guān)系方面。Let-7家族對細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)的上游信號分子RAS通過多位點(diǎn)結(jié)合發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，此點(diǎn)已被研究證實(shí)［13］。另外，在let-7家族成員中非常值得關(guān)注的是，日本巖手醫(yī)科大學(xué)佐藤衛(wèi)等的研究提示［8］，let-7i和冠心病具有直接的關(guān)聯(lián)。用于冠心病預(yù)防和治療的降脂藥阿托伐他汀的一部分治療作用就是通過調(diào)節(jié)let-7i實(shí)現(xiàn)的。因此，let-7i被挑選進(jìn)行了實(shí)驗驗證。實(shí)驗驗證的結(jié)果和理論預(yù)計完全一致，let-7i的功能水平和ADRB2基因的蛋白表達(dá)呈明顯的負(fù)相關(guān)。由此進(jìn)一步證實(shí)了let-7家族對ADRB2基因存在調(diào)控作用的預(yù)測。此外，其它候選miRNA也值得關(guān)注，例如 miR-98與血管損傷有關(guān)［14］，此外更值得關(guān)注的是，在血管加壓素-Ⅱ所誘導(dǎo)的心肌肥厚中，miRNA-98和let-7的變化表現(xiàn)出聯(lián)動性［15］。

目前的研究是基于心肌細(xì)胞的分子生物學(xué)研究，進(jìn)一步采用實(shí)驗動物的在體研究以及采用臨床病例的應(yīng)用研究是值得深入的研究方向。

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