rhFSH對雄激素致不孕大鼠局灶性腦缺血大腦皮質AKT及PDGF－B基因表達的影響

周家文，陸玉熊，李洪巖，項喜艷，張 勇，孫連坤，康勁松＊

（1.吉林大學中日聯誼醫院 婦產科，吉林 長春130033；2.吉林大學白求恩醫學院病理生理學教研室，吉林 長春130021）

大量的臨床研究資料表明由于性別的不同，中風的發生率及結局明顯不同［1］。女性在絕經前中風發病率較同年齡段男性低，但絕經后發病率明顯上升。臨床回顧性研究發現絕經后的女性接受雌激素或雌激素加孕酮治療者，中風發病率和病死率均下降，說明性激素在中樞神經系統損傷中起一定作用［2，3］。本實驗所采用的大鼠均為雄激素致不孕大鼠（ASR），是一種由高雄激素引起的無排卵的動物模型［4］。這種動物模型除可作為不孕大鼠模型外，還可以用于觀察體內性激素紊亂對機體的影響。重組人促卵泡激素（rhFSH）具有促進雌激素分泌的作用，研究表明，FSH的新功能已被確認超出繁殖調控，在中樞神經系統損傷調控中起一定作用。果納芬是臨床上常用一種FSH。本實驗的目的是在成功建立ASR模型的基礎上給予rhFSH治療后，線栓法制作大鼠大腦中動脈（MCAO）模型，用以探討果納芬（rhFSH）對缺血大腦皮層AKT及PDGF－B基因表達的影響及腦保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；RT－PCR試劑購自日本Takara公司；PCR引物合成由中國聯星公司完成；瓊脂糖和M－MuLV反轉錄酶購自美國Promega公司；DEPC（焦磷酸二乙酯）購自美國Sigma公司；重組人促卵泡激素（果納芬）（批號：Y02A7773）由雪蘭諾公司瑞士藥廠購買。PCR擴增儀購自日本Takara公司；凝膠成像分析系統購自中國上海天能科技有限公司；RNA定量儀來自德國Eppendorf；電 泳 儀 和－80℃ 低 溫 冰 箱 由 日 本SANYO公司生產；高速低溫離心機由日本久寶田生產。

1.2 雄激素致不孕大鼠（ASR）模型的制備

健康9日齡Wistar雌性幼鼠，購于吉林大學實驗動物中心，體重（20±2）g。參照本室方法［4］：采用9日齡的雌性大鼠頸背部皮下一次性注射丙酸睪酮1.25mg·只－1（0.05ml·只－1），復制雄激素致不孕大鼠模型。第70天起進行連續陰道上皮細胞涂片11d，陰道上皮細胞持續角化無動情周期出現者，提示無排卵大鼠模型制作成功。

1.3 動物分組及給藥方法

將復制成功的成年Wistar雌性不孕大鼠（ASR）隨機分為 ASR＋sham組、ASR＋MCAO組、ASR＋rhFSH＋sham組及 ASR＋rhFSH ＋MCAO組。前2組每日肌內注射生理鹽水（200μl／只），后2組每日肌內注射16IU·200μl－1·只－1rhFSH，連續12d。在肌注的第11天，進行大腦中動脈阻塞模型的制備。

1.4 大鼠大腦中動脈阻塞（MCAO）模型的制備

利用本室常規方法成功制備大鼠MCAO模型［5］，24h后斷頭處死各組動物，迅速分離大腦皮質，液氮凍存備用。

1.5 基因表達檢測

大腦皮質總RNA的提取參照Trizol試劑盒的方法提取總RNA。經逆轉錄合成cDNA，分別使用GAPDH，AKT，PDGF－B的引物進行PCR反應。GAPDH 引 物：Sense：5’－GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT－3’，Antisense：5’–AAGAATGGGTGTTGCTGTTGAAGTC－3＇，PCR 循 環 條 件為：94℃，30s，退火58℃，30s，延伸72℃，60s，28個循環，擴增目的片段為617bp。AKT引物：Sense：5’－TCTACGGTGCGGAGATTGTG－3’，Anti－sense：5′－TCCCGG－TACACCACGTTC TT－3′，PCR循環條件為變性94℃，30s，退火57℃，45 s，延伸72℃，45s，30個循環，PCR產物為78bp。PDGF－B 引 物：Sense：5′－GAAGCCAGTCTTCAAG AAGGCCAC －3′，Anti－sense：5′－AACGGTCACCCGAGTTTGAGGTGT－3′PCR 循環條件為變性94℃，30s，退火57℃，45s，延伸72℃，45s，30個循環，PCR產物為171bp。30個循環后取PCR產物進行瓊脂糖2%凝膠電泳，凝膠成像系統分析目的條帶光密度值，以目的基因與內參GAPDH比值確定其含量。

1.6 統計方法

2 結果

2.1 行為學評分

在大腦中動脈阻塞后，分別在大鼠清醒時（0h）及24h進行神經行為學評分。ASR＋sham組與ASR＋rhFSH＋sham組均為假手術組，大鼠行為無異常，得分為0。ASR＋MCAO組大鼠清醒后即出現明顯的神經運動功能障礙體征，右側肢體肌力下降，提尾時右前肢內收屈曲，爬行時偏向右側打圈，甚至向右側傾倒，其平均得分為3.10±0.43；ASR＋rhFSH＋MCAO組大鼠神經運動功能障礙體征明顯減輕，其平均得分為2.30±0.32，與ASR＋MCAO組相比具有統計學意義（P＜0.05）。24h時測定神經行為評分，無論ASR＋MCAO組還是ASR＋rhFSH＋MCAO組大鼠的神經運動功能均得到一定的改善，但ASR＋rhFSH ＋MCAO組神經行為評分明顯低于ASR＋MCAO組（P＜0.05）（見表1）。

表1 rhFSH對雄激素致不孕大鼠（ASR）局灶性腦缺血神經行為評分的影響

2.2 rhFSH對雄激素致不孕大鼠局灶性腦缺血大腦皮質AKT的影響

RT－PCR電泳結果表明，與ASR＋sham組比較，ASR＋rhFSH＋sham組的AKT mRNA表達水平未見明顯改變（P＞0.05）；與ASR＋sham組比較，ASR＋MCAO組大鼠大腦皮質缺血側AKT mRNA的表達明顯降低（P＜0.05）。與 ASR＋rhFSH＋sham組比較，ASR＋rhFSH＋MCAO組大鼠缺血側大腦皮質AKT mRNA的表達均未見明顯改變（P＞0.05）（見圖1）。

2.3 rhFSH對雄激素致不孕大鼠局灶性腦缺血大腦皮質PDGF B的影響

RT－PCR電泳結果表明，與ASR＋sham組比較，ASR＋rhFSH＋sham組的PDGF B mRNA表達水平未見明顯改變（P＞0.05）；與ASR＋sham組比較，ASR＋MCAO組大鼠大腦皮質缺血側PDGF mRNA的表達明顯增高（P＜0.05）。與 ASR＋rhFSH＋sham組比較，ASR＋rhFSH＋MCAO組大鼠缺血側大腦皮質PDGF B mRNA的表達亦明顯增高（P＜0.05）（見圖2）。

圖1 rhFSH對雄激素致不孕大鼠局灶性腦缺血大腦皮質中AKTmRNA表達的影響

圖2 rhFSH對雄激素致不孕大鼠局灶性腦缺血大腦皮質中PDGF B mRNA表達的影響

3 討論

研究表明，體內性激素的變化在腦損傷過程中起一定作用［6］，但性激素對 AKT和PEGF－B在腦損傷的影響未見報道。本研究在雄激素致不孕大鼠（androg en－induced sterile rats，ASR）的基礎上，給予重組人促卵泡激素（recombinant human follitropin，rhFSH）治療后，通過線栓法又制備了大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，用以探討體內性激素的變化對局灶性腦缺血AKT及PEGF－B的影響。

Akt又名蛋白激酶B（protein kinase B，PKB），是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，在神經生長因子依賴的細胞存活信號途徑中具有重要作用，缺血的短時間內增加其活性可起到保護神經元損傷作用，而其活性的下降是腦缺血神經細胞損傷的主要原因。大量的研究表明，Akt表達量增加可顯著減少缺血損傷的面積、抑制細胞凋亡［7］。本實驗的結果證明局灶性腦缺血組缺血側大腦皮質中Akt的mRNA水平明顯降低，是腦缺血神經細胞損傷的一個主要原因，在給與rhFSH治療后，Akt的mRNA水平明顯增加，提示雌激素通過上調Akt的表達，激活PI3－K／Akt通路，從而減輕腦損傷。

血小板衍生生長因子（PDGF）是一種具有廣泛生物學作用的多肽，它是體內較強的促有絲分裂劑和化學誘導劑，與機體組織的生長、發育以及各種損傷后修復有密切的關系。研究表明，PDGF在腦損傷修復及促進血管重塑中具有重要作用。外源性PDGF－B可以預防大鼠腦缺血后的遲發性神經元死亡，產生神經保護效應［8］。PDGF－Rβ在卒中后血管重塑過程中是一個關鍵因子，PDGF－B的營養功能可以通過受體的表達來進行調節［9，10］。卒中后，PDGF－B／PDGF－Rβ系統通過介導內皮細胞與周細胞的的相互作用來支持血管再生以及重塑，參與神經保護作用。新生血管的生長可能由于能夠增加對缺血組織營養和氧氣的運送，從而增加缺血缺氧的耐受性，減輕缺血缺氧的損傷。本實驗中在給與rhFSH治療后，PDGFB的mRNA水平明顯增加，提示雌激素可加速血管的生成，進一步促進腦損傷的修復。

綜上所述，rhFSH可能通過對AKT及PDGF的調節，促進血管增生以及重塑，導致細胞存活增多，從而減輕腦損傷。

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［5］周家文，孫際童，王 巖，等.大鼠局灶性腦缺血腦皮質線粒體氯通道基因的表達［J］.中國老年學雜志，2008，28（16）：1561.

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