應用基因測序方法檢測哮喘兒童的PTEN基因突變

趙宏霞，曹 敏，鐘慧君，劉 瑜

（南方醫科大學附屬深圳婦幼保健院 兒內科，廣東 深圳518028）

支氣管哮喘為小兒的常見病、多發病，近年來其發病率有逐年增高趨勢，世界范圍內兒童哮喘流行病學調查結果顯示，兒童哮喘患病率較10年前明顯升高，全世界每年因哮喘而死亡的病人數高達10萬人，哮喘已成為當今世界威脅公共健康最常見的慢性肺部疾病，其造成的社會負擔超過艾滋病與肺結核的總和［1，2］。

近幾年，哮喘遺傳相關基因成為研究的熱點。PTEN基因是一個具有雙重特異性磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，它在過敏性氣道炎癥中的作用近年來逐漸受到國內外學者的關注。韓國學者Yong等首次報道了PTEN在過敏性炎癥中的作用，指出PTEN可能通過抑制哮喘模型鼠氣道內嗜酸性粒細胞（eosinophils，EOS）脫顆粒和活化，降低IL－4、IL－5的濃度，從而減輕嗜酸性粒細胞炎癥和氣道高反應性［3］。

本實驗擬對哮喘及健康兒童的PTEN基因第5、第8外顯子進行DNA測序分析，檢測其基因突變情況，并計數外周血EOS，初步探討PTEN基因突變與兒童哮喘的相關性，及其與外周血EOS的關系，進一步探究兒童哮喘的發病機理，為兒童哮喘預防及控制藥物的藥物研發等提供一定的理論和實驗依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象及分組

1.1.1 哮喘組 2011年1月到2011年12月于本院門診隨診的30例哮喘患兒（臨床緩解期），男、女各15例；年齡3－15歲，平均4.8歲。均符合兒童支氣管哮喘診斷標準，入組前一周無使用激素及急性感染性疾病病史。

1.1.2 對照組 2011年1月到2011年12月于本院健康體檢兒童30例，男16例，女14例；年齡3－15歲，平均4.9歲。均無過敏性疾病病史，入組前一周無使用激素及急性感染性疾病病史。

兩組兒童性別、年齡差異均無統計學意義，具有可比性。兩組兒童家長均知情同意參加該項課題研究。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 兩組兒童均于清晨空腹留取外周靜脈血2ml，1ml提取全基因組DNA，－20℃冰箱凍存備檢；其余1ml做血涂片。

1.2.2 DNA提取 全血1ml加入適當體積磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）、蛋白酶－K消化，使用飽和酚及酚－氯仿－異戊醇混合液依次進行抽提，提取出的DNA用無水乙醇沉淀，70%乙醇洗滌，干燥后加細胞裂解液溶解。

1.2.3 PTEN目的基因擴增 exon－5、exon－8引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列祥見表1。

表1 引物名稱及序列

PCR反應體系總體積為25μl，其中模板DNA1 μl，dNTP 0.25mmol／L，Taq DNA聚合酶0.25μl，引物0.8μmol／L，Mg2＋2.5mmol／L。

反應條件：94℃5min預變性；94℃30s、52℃30s、72℃60s擴增40個循環；72℃ 延伸10min。

取PCR產物10μl在2%瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳產物進行回收、純化。

1.2.4 基因測序 采用美國PE ABI公司310型DNA測序儀進行測序。利用DNASIS MAX V3.0軟件對測序結果進行分析。

1.2.5 EOS計數 于400倍高倍鏡下進行外周血嗜酸粒細胞計數。

1.2.6 統計學分析 計數資料采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗，用SPSS 13.0進行統計分析，P＜0.05差異有顯著意義。

2 結果

2.1 PTEN基因突變與兒童哮喘的關系

2.1.1 哮喘組和對照組PTEN基因第5外顯子未發現存在基因突變。

2.1.2 哮喘組PTEN基因第8內含子的第32個堿基發生突變，T→G，突變率為83.3%（25／30）。對照組物基因突變。突變位點見圖1所示。

2.2 外周血EOS計數結果

2.2.1 哮喘組兒童外周血EOS計數明顯高于對照組兒童，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2所示。

2.2.2 哮喘患兒中，根據有無發生PTEN基因第8內含子突變，分為基因突變組和基因正常組，組間性別、年齡差異均無統計學意義。PTEN基因發生突變的哮喘患兒外周血EOS計數高于無突變的哮喘兒童，差異顯著（P＜0.05），見表3所示。

圖1 PTEN基因第8內含子基因突變位點圖

表2 哮喘組和對照組兒童外周血EOS計數比較（±s）

表2 哮喘組和對照組兒童外周血EOS計數比較（±s）

組別 n EOS（×106／L）30 435±108對照組 30 172±83 t 25.632 P＜0.哮喘組001

表3 哮喘患兒中基因突變組和基因正常組外周血EOS計數比較（±s）

表3 哮喘患兒中基因突變組和基因正常組外周血EOS計數比較（±s）

組別 n EOS（×106／L）26 574±129基因正常組 4 352±86 t 2.703 P＜0.02基因突變組

3 討論

支氣管哮喘是臨床上最常見的Ⅰ型變態反應性疾病，是由嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、呼吸道上皮細胞和樹突狀細胞等多種炎性細胞和細胞組分共同參與的呼吸道慢性炎癥性疾病。其關鍵的效應細胞是T輔助細胞和EOS。

10號染色體上磷酸酶與張力蛋白同源缺失性（PTEN）基因是一個具有雙重特異磷酸酶活性的抑癌基因，其定位于10q23.3上，全長200kb，包含9個外顯子和8個內含子，編碼由403個氨基酸組成的細胞質蛋白［4］。PTEN 基因主要通過PIK3／AKT信號途徑的負性調節，對細胞增殖、生長、凋亡、黏附、遷移和血管生長等進行調節［5］。PTEN基因是人類腫瘤中突變率最高的抑癌基因［6］。目前只第9外顯子未發現有突變，其中第5及8外顯子有較高突變率。第5外顯子是編碼磷酸酶的功能區，第8外顯子是PTEN的穩定性和磷酸酶生物學活性的調節區。

近年研究發現PTEN基因在非腫瘤性疾病中也發揮著重要的作用。韓國學者Yong等首次報道了PTEN在過敏性炎癥中的作用，指出PTEN可能通過抑制哮喘模型鼠氣道內EOS脫顆粒和活化，降低IL－4、IL－5濃度，從而減輕嗜酸性粒細胞炎癥和氣道高反應性［2］。有研究發現PTEN基因通過EOS存活和趨化的負向調節在過敏性炎癥中發揮重要作用，PTEN可能成為治療嗜酸粒細胞性疾病的新靶點［7］。也有學者研究提示PTEN的過表達可降低嗜酸細胞陽離子蛋白水平，減輕氣道炎癥和滲出［8］。目前國內外對于PTEN基因突變與哮喘的相關性研究報道相對較少。

本實驗應用DNA測序法對哮喘及健康兒童PTEN基因第5、第8外顯子進行檢測，結果發現：哮喘組兒童第5、8外顯子無突變；第8內含子存在突變，即第32個堿基點突變，T→G，突變率達83.3%（25／30）；健康兒童組第5、第8外顯子、內含子均無突變。

內含子是非編碼蛋白質序列，隨著對功能基因的逐步深入研究，越來越多的學者發現內含子在基因表達調控中有著重要的生物學功能，它不僅對基因表達有正調控作用，也存在負調控作用，有的內含子對基因表達有雙向調控作用。在真核生物基因中內含子的存在是普遍現象，內含子的長度遠遠大于外顯子的長度，甚至在人類基因組中非編碼序列占到95%－97%。目前普遍認為內含子含有增強子或其他順式作用元件，促進轉錄的起始或延伸，并增加了mRNA在核內的穩定性，可充當啟動子等。內含子在基因表達中具有位置效應和方向依賴性，具有選擇剪接功能，內含子在選擇剪接過程中可以起標點符號作用來分開外顯子，或提供支持選擇剪接機制的作用。通過選擇性剪接使單一基因產生多種蛋白質，參與基因轉錄、mRNA運輸及翻譯等［9］。內含子的嵌入增加了基因在轉錄過程中多樣性的同時也提高了其靠性。最近研究發現內含子突變也會影響基因表達效應，引起表型顯著改變。有學者發現雌激素受體α（ESRα）基因的內含子中存在突變，導致其繁殖和生產性狀發生改變［10］。胰島素樣生長因子2（IGF2）3號內含子的A3072G的突變與豬生長發育和骨骼構成有關［11］。也有研究發現抑癌基因p53 7號內含子的基因多態性與口腔腫瘤的發病有關［12、13］。隨著分子生物學理論及技術的進步，推測在內含子與外顯子交界處的內含子突變會導致外顯子的缺失或內含子不被剪切，發生在內含子中間的突變則因激活隱形剪切位點影響正常剪切導致疾病發生。

本實驗結果哮喘兒童組第8內含子第32個堿基的突變，我們推測實驗中發現的PTEN基因第8內含子的單堿基突變，可能通過影響RNA的選擇性剪切，使得該基因編碼了不同蛋白質，從而改變PTEN基因在哮喘兒童中的表達效應導致哮喘發生。

嗜酸性粒細胞（EOS）是支氣管哮喘的主要效應細胞，聚集活化的EOS可以分泌多種炎性物質，引起氣道上皮細胞損傷，導致支氣管平滑肌收縮，微血管滲漏，黏膜水腫，產生氣道高反應和哮喘發作。EOS導致氣道阻塞和氣道結構的改變，也參與氣道炎癥反應及氣道重塑，還參與抑制氣道的免疫反應，EOS在氣道粘膜的浸潤是哮喘重要的組織病理學特征之一。本實驗中哮喘兒童外周血EOS計數明顯高于健康兒童，證實了嗜酸粒細胞在哮喘發病中的重要作用。同時本實驗中發生PTEN基因突變的哮喘患兒外周血EOS計數較無突變的哮喘患兒高。國外已有多項研究指出PI3K／AKT信號途徑是PTEN基因進行負性調節的主要途徑［14］，PTEN基因可能通過抑制EOS的活化和趨化在哮喘中發揮重要作用［2，7］。也有研究表明在EOS的激活和趨化過程中炎癥介質通過PI3K信號轉導途徑發揮一定作用［15］，β受體激動劑可通過PI3K／AKT信號途徑調控氣道EOS的凋亡。由此我們推測PTEN基因可能通過PI3K／AKT信號途徑對EOS進行負性調節，抑制EOS的活化和趨化。由于第8內含子的單堿基突變，改變了PTEN基因的表達，影響了它對EOS的負性調控功能，使得哮喘患兒外周血的EOS數量增多，促發了慢性氣道過敏性炎癥的發生。

本實驗發現PTEN基因在兒童支氣管哮喘中存在第8內含子的單堿基突變，它可能通過對EOS的調節在哮喘氣道的過敏性炎癥中發揮重作用。相信通過后續對哮喘兒童PTEN基因的進一步研究，將為哮喘綜合治療新策略提供更多的可靠依據。

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