Bcl-2基因抑制神經細胞凋亡的實驗研究

韓貴和 魏 威 顧 軍 汪翼凡 應小樟 杭州市紅十字會醫院骨科 杭州310003

·論 著·

Bcl-2基因抑制神經細胞凋亡的實驗研究

韓貴和 魏 威 顧 軍 汪翼凡 應小樟 杭州市紅十字會醫院骨科 杭州310003

目的：觀察原癌基因bcl-2對神經細胞凋亡的抑制作用。方法：培養PC12細胞至對數生長期，用100感染復數（multiplicity of infection，MOI）的攜帶bcl-2基因的慢病毒質粒及未攜帶bcl-2基因的慢病毒質粒感染PC12細胞。再將其分為A、B、C、D四組，A組為攜帶bcl-2基因慢病毒質粒的PC12細胞（bcl-2-PC12細胞），B組為未攜帶bcl-2基因慢病毒質粒PC12細胞（NC-PC12細胞），C組為bcl-2慢病毒質粒PC12細胞加H2O2（bcl-2-PC12細胞+H2O2），D組為NC慢病毒質粒PC12細胞加H2O2（NC-PC12細胞+H2O2）。應用流式細胞儀檢測細胞的凋亡率，采用BCA（bicinchoninic acid）法檢測bcl-2基因表達蛋白。結果：A組細胞凋亡率低于B組（P＜0.05），C組細胞凋亡率低于D組（P＜0.05）；A組bcl-2基因蛋白濃度高于B組（P＜0.05），C組bcl-2基因蛋白濃度高于D組（P＜0.05）。結論：bcl-2基因對正常神經細胞的凋亡有抑制作用，能夠增強神經細胞的抗損傷能力。

bcl-2基因 神經細胞 凋亡

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）可導致嚴重的神經系統功能障礙，如截癱和四肢癱。目前尚無一種方法能使SCI患者的神經功能得以明顯恢復。基因治療（gene therapy）是當前生物醫學研究迅猛發展的領域之一［1-2］，有望改善SCI患者的神經功能。自1997年Chen等發現原癌基因bcl-2能促進哺乳動物切斷的中樞神經軸突的再生后，眾多學者對bcl-2基因的作用進行了探索，并且取得了令人矚目的研究進展［3-4］。PC12細胞是從大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤克隆的神經細胞株，常用于實驗研究。本研究對bcl-2基因抑制PC12細胞凋亡及增強其抗損傷的作用做了一些探索，獲得了滿意的結果，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM培養基（美國Gibco公司）、H2O2（無錫市晶科化工有限公司）、胎牛血清（FBS，蘭州民海生物有限公司）、馬血清（HS，美國Hyclone公司）、胰蛋白酶（美國Gibco公司）、Alexa Flour 488 annexin V∕Dead Cell Apoptosis Kit（美國Invitrogen公司）。

1.2 主要儀器 二氧化碳培養箱（3111型，美國Thermo公司）、倒置熒光顯微鏡（DMIL型，德國Leica公司）、臺式離心機（上海醫療器械有限公司）、流式細胞儀（美國BD公司）、電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.3 PC12細胞和慢病毒質粒 PC12細胞（購于中科院上海細胞庫）、攜帶bcl-2基因的慢病毒質粒（bcl-2慢病毒質粒，購于上海吉瑪生物公司）、不攜帶bcl-2基因的慢病毒質粒（NC慢病毒質粒，購于上海吉瑪生物公司）。

1.4 細胞培養 從液氮罐復蘇PC12細胞，10%FBS+ 5%HS，1×青-鏈霉素DMEM培養基，37℃，5%CO2培養箱，傳代2～3次使細胞完全恢復。

1.5 慢病毒質粒轉染 取對數生長期PC12細胞胰酶消化，1 200r∕min離心5min，收集細胞，以DMEM完全培養基輕輕吹打混勻細胞，細胞計數，以1×105∕孔細胞量鋪布6孔培養板，待細胞完全貼壁后細胞匯合度50%左右，換新鮮培養基準備轉染。用100感染復數（multiplicity of infection，MOI）病毒感染PC12細胞。

1.6 H2O2損傷細胞 將轉染bcl-2慢病毒質粒的PC12細胞及轉染NC慢病毒質粒的PC12細胞，取對數生長期細胞胰酶消化，細胞計數，以1×105∕孔細胞量鋪布6孔培養板，各組細胞棄舊培養液，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，換上無血清DMEM孵育24h使細胞同步化。棄舊培養液，PBS液清洗2次。將上述兩種細胞分為A、B、C、D四組，即A組為單純bcl-2慢病毒質粒PC12細胞（bcl-2-PC12細胞），B組為單純NC慢病毒質粒PC12細胞（NC-PC12細胞），C組為bcl-2慢病毒質粒PC12細胞加H2O2（bcl-2-PC12細胞+ H2O2），D組為NC慢病毒質粒PC12細胞加H2O2（NC-PC12細胞+H2O2）。C、D組細胞以1mmol∕LH2O2作用1h對其進行損傷。

1.7 PI染色流式細胞術檢測細胞凋亡 胰酶消化上述細胞，1 200r∕min離心5min，收集細胞，用4℃PBS液洗滌2次，加入100μL1Xannexin-binding buffer溶解，按照凋亡檢測試劑盒操作，依次加入5μLAnnexin V和1μL100μg∕m lPI，孵育15min，再加入400μL1Xannexin-binding buffer后上機檢測。

1.8 Western blot法檢測bcl-2基因表達蛋白

1.8.1 蛋白樣品制備 吸取細胞培養液1mL，備用。每瓶細胞加2mL 4℃的PBS，輕輕搖動1min洗滌細胞，然后棄去洗液。用胰酶消化貼壁細胞，并收集至備用的4℃細胞培養液中。1 200r∕min離心5min，收集細胞，小心吸除上清液。PBS洗滌1次，吸除上清液后加1mLPBS重懸，將細胞轉移到1.5mL離心管中，1200r∕min離心5min，收集細胞。按1mL裂解液加10μL PMSF（100mM），混合均勻。每瓶細胞加100μL含PMSF的裂解液，在4℃下裂解30min，為使細胞充分裂解，EP管要經常搖動。裂解完畢，于4℃、12 000r∕min離心10min。將離心后的上清液轉移到新的離心管中，于-70℃條件下保存。

1.8.2 BCA（bicinchoninic acid）法測定蛋白濃度將0.5mg∕mL標準牛血清蛋白按0、1、2、4、8、12、16、20μL分別加到96孔板的標準品孔中，加標準品稀釋液補足到20μL。樣品用標準品稀釋液稀釋一定濃度后加20μL到96孔板中。按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B（50:1）配制適量BCA工作液，充分混勻，各孔加入200μL BCA工作液，37℃放置30min。測定562nm處的吸光度值，根據標準曲線計算樣品的蛋白濃度。

1.9 統計學方法 應用SPSS10.0統計軟件進行統計分析，先做正態性分析，數據以均數±標準差（）表示。細胞凋亡的分布符合二項分布，故細胞凋亡率的比較采用U檢驗。蛋白濃度服從正態分布，進行F檢驗，成組資料t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 bcl-2基因對PC12細胞凋亡率的影響 A組細胞凋亡率8.11%較B組15.63%低（U=2.16，P＜0.05），C組細胞凋亡率12.27%較D組26.38%低（U=2.38，P＜0.05）。說明bcl-2基因可抑制PC12細胞的凋亡，增強PC12細胞的抗損傷能力，見圖1。

圖1 細胞凋亡率圖示

2.2 bcl-2基因對PC12細胞表達蛋白的影響 A組bcl-2基因表達蛋白濃度高于B組（t=2.87，P＜0.05），說明A組存活細胞數多，bcl-2基因表達蛋白濃度高，bcl-2基因具有抗凋亡作用。C組bcl-2基因表達蛋白濃度高于D組（t=2.87，P＜0.05）。說明在細胞受到損傷時，bcl-2基因表達蛋白濃度高的細胞，抗損傷能力強，證明bcl-2基因具有增強神經細胞的抗損傷作用。見表1。

表1 bcl-2蛋白濃度（） μg∕L

表1 bcl-2蛋白濃度（） μg∕L

注：與D組比較，△P＜0.05

組別A組B組C組D組n 10 10 10 10蛋白濃度0.56±0.02 0.46±0.02 0.32±0.02△0.18±0.02

3 討 論

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）可導致嚴重的神經系統功能障礙如截癱和四肢癱。SCI造成的影響比較廣泛，可影響到運動、呼吸、消化、泌尿和生殖系統等多個器官的正常功能。目前，國內外在脊髓損傷的綜合治療方面主要采取以下兩個策略：①在急性期使用神經保護劑，以阻止損傷的進一步發展。這種療法包括提高氧合能力、清除自由基及各種生化紊亂。②在亞急性期和后期使用神經營養因子（neurotrophic factors，NTF）以防止神經元營養匱乏并促進軸突生長，也可聯用神經元移植和遺傳工程細胞導入的方法；同時采用與髓鞘形成有關的抑制蛋白抗體來促進軸突的長距離再生能力。遺憾的是，目前尚無一種方法能使SCI患者的功能得以明顯恢復。

基因治療（gene therapy）是指將限定的遺傳物質轉入患者特定的靶細胞，以最終達到預防或改變特殊疾病狀態為目的的治療方法。原癌基因Bcl-2是一種與細胞凋亡密切相關的癌基因。1997年Chen等發現Bcl-2基因能促進切斷的哺乳動物中樞神經軸突的再生，第一次為脊髓損傷后的神經元再生提供了理論依據［5］。Takahashi等［6］研究發現，在脊髓損傷后注射攜帶Bcl-2基因的DNA質粒能減少神經元的凋亡。Shimazaki等［7］利用腺伴隨病毒載體轉導Bcl-2基因至中樞神經系統進行表達，證實了轉導基因治療中樞神經損傷—腦缺血再灌注損傷的可能性。已有大量文獻［8-10］表明，無論體內還是體外，bcl-2基因對于損傷導致的神經細胞凋亡有明顯的保護作用。本研究結果顯示，轉染攜帶bcl-2慢病毒的PC-12細胞組（A組）凋亡率低于未攜帶bcl-2慢病毒的PC-12細胞組（B組）（P＜0.05）。bcl-2基因表達蛋白濃度測定顯示，A組高于B組（P＜0.05），說明bcl-2基因對正常PC12細胞的凋亡有抑制作用，能延長PC12細胞的壽命。C組（bcl-2-PC12+H2O2）細胞凋亡率低于D組（NC-PC12+H2O2）（P＜0.05），bcl-2基因表達蛋白濃度高于D組（P＜0.05），證明bcl-2基因能夠增強PC12細胞的抗損傷能力。盡管有大量的研究證明bcl-2基因有抗細胞凋亡作用，能夠增強細胞對抗損傷的能力，但bcl-2基因轉染至細胞內，有可能導致細胞無限制生長，使機體罹患癌癥。

［1］Blits B，BungeMB.Directgene therapy for repair of the spinal cord［J］.JNeurotrauma，2006，5（3-4）:508-520.

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［3］Seki T，Hida K，TadaM，etal.Role of the Bcl-2 gene after contusive spinal cord injury in mice［J］.Neurosurgery，2003，53（1）:192-198.

［4］Kumar A，Singh TD，Singh SK，etal.Methods，potentials，and limitations of gene delivery to regenerate central nervoussystem cells［J］.Biologics，2009，3（2）:245-256..

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［6］Takahashi K，Schwarz E，Ljubetic C，et al.DNA plasmid that codes for human Bcl-2 gene preserves axotomized Clarke’s nucleus neurons and reduces atrophy after spinal cord hemisection in adult rats［J］.JComp Neurol，1999，404（2）：159-171.

［7］Shimazaki K，Urabe M，Monahan J，etal.Adeno-associated virus vector-mediated Bcl-2 gene transfer into post-ischemic gerbil brain in vivo:prospects for gene therapy of ischemia-induced neuronaldeath［J］.Gene Ther，2000，7（14）：1244-1249.

［8］Zhao H，Yenari MA，Cheng D，et al.Bcl-2 overexpression protects against neuron loss within the ischemic margin following experimental stroke and inhibits cytochrome translocation and caspase-3 activity［J］.JNeurochem，2003，85（9）：1026-1036.

［9］Yamashita S，Mita S，Kato S，et al.Bcl-2 expression using retrograde transport of adenoviral vectors inhibits cytochrome c-release and caspase-1 activation in motor neurons ofmutant superoxide dismutase 1（G93A）transgenic mice［J］.Neurosci Lett，2003，350（1）：17-20.

［10］Yukawa Y，Lou J，Fukui N，et al.Optimal treatment timing to attenuate neuronal apoptosis via Bcl-2 gene transfer in vitro and in vivo［J］.JNeurotrauma，2002，19（8）：1091.

Inhibiting Role of Bcl-2 Gene in the Apoptosis of Nerve Cells

HAN Guihe，WEIWei，GU Jun，et al. Hangzhou Red Cross Hospital，Hangzhou(310003)，China

Objective:To observe the inhibiting role of the proto-oncogene bcl-2 in the apoptosis of nerve cells. M ethods:PC12 cells were cultured to the logarithmic growth phase and then slow virus plasmid carrying the bcl-2 gene and slow virus plasmid infected PC12 cells by 100 multiplicity of infection,respectively.The PC12 cells infected were then divided into 4 groups.Group A：PC12 cells with slow virus plasmid carrying the bcl-2 gene；group B：PC12 cells with slow virus plasmid；group C：PC12 cells with slow virus plasmid carrying the bcl-2 gene，which were damaged by H2O2；group D：PC12 cells with slow virus plasmid，which were damaged by H2O2.The rate of apoptosis was detected by flow cytometry.The proteinum concentration of bcl-2 gene expression was detected by using bicinchoninic acid method.Results:The apoptosis rate of group A was lower than that of group B and the protein concentration of bcl-2 gene expression of group A was higher than that of group B，both of which were significantly different between the 2 groups（P＜0.05）.The apoptosis rate of group C was lower than that of group D and the protein concentration of bcl-2 gene expression of group C was higher than that of group D，both of which significantly differed between the 2 groups（P＜0.05）.Conclusion:Bcl-2 gene can inhibit apoptosis of normal nerve cells and can enhance resistance ability of nerve cell to be damaged.

bcl-2 gene nerve cells apoptosis

2012-11-19

杭州市科技發展計劃（No.20100733Q22）