基于QbD理念的丹參醇提工藝設計空間的建立與驗證

羅 贛 徐 冰 劉 倩 李 洋 史新元 喬延江

（北京中醫藥大學中藥信息工程研究中心，北京，100029）

基于QbD理念的丹參醇提工藝設計空間的建立與驗證

羅 贛 徐 冰 劉 倩 李 洋 史新元 喬延江

（北京中醫藥大學中藥信息工程研究中心，北京，100029）

目的：建立并驗證丹參醇提工藝的設計空間。方法：以隱丹參酮、丹參酮IIA提取率為關鍵質量屬性（CQA），以乙醇濃度、乙醇倍量、煎煮時間為關鍵工藝參數（CPP），采用中心點復合設計安排實驗，基于二次多項式回歸模型開發丹參醇提工藝設計空間。結果：方差分析結果顯示模型的P值均小于0.05，且失擬值均大于0.1，表明該模型可以較好的描述CQA和CPP之間的關系.設計空間以Overlay plot展示，在加入95%置信區間后，可縮小設計空間范圍并提高其可靠性。結論：基于質量源于設計（QbD）理念建立丹參醇提工藝設計空間可以提高工藝過程的穩健性和靈活性。

質量源于設計；丹參；乙醇提取；設計空間；過程穩健性

人用藥物注冊技術標準國際協調會（ICH）于2005年出臺的ICH Q8［1］中提出了“質量源于設計（Quality by Design，QbD）”的理念，QbD是將科學的方法和風險管理的理念應用于藥品工藝開發和生產全過程。實施QbD的核心之一在于為制劑工藝建立設計空間。在ICH Q8中設計空間被定義為：可以確保產品質量的輸入變量（例如原材料的質量屬性）和工藝參數之間的多維組合與相互作用。

目前，設計空間已應用于化學藥品的干燥［2］、混合［3］、制粒［4］、包衣［5］等生產過程，以及生物制品的菌苗培養［6］等過程，但在中藥制劑生產過程中的應用較少［7-8］。本文以丹參醇提過程作為研究對象，“將質量源于設計”的理念和“設計空間”（Design space）的方法應用于中藥提取過程，從設計層面保證丹參提取物的質量，利用響應面方法設計實驗，建立基于QbD理念的丹參醇提工藝設計空間并進行了驗證。

1 儀器與試藥

Agilent1100液相色譜儀（美國安捷倫公司）；電熱套（北京中興偉業儀器有限公司）、DZF-6050型真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）、Sartorius BS210S天平（德國賽多利斯公司）。

丹參飲片（購自北京本草方源藥業有限公司，批號20120402），對照品隱丹參酮、丹參酮IIA（購自中國食品藥品檢定所，批號分別為110852-200806和110766 -200619），乙腈、甲醇（色譜純，Fisher），其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 丹參提取物制備 取丹參飲片500 g，加乙醇回流提取2次，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇，濃縮，80℃干燥，粉碎成細粉。

2.2 丹參藥材中隱丹參酮和丹參酮IIA的含量測定

1）對照品溶液的制備：精密稱取隱丹參酮、丹參酮IIA適量，以甲醇為溶劑，配置成濃度為含隱丹參酮30 μg／mL、丹參酮IIA 130μg／m L的混合對照品溶液。

2）供試品溶液的制備：取丹參粉末（過三號篩）約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1h，放冷，甲醇補足重量，搖勻，濾過，取續濾液即得。

3）色譜條件：Agilent SB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），柱溫25℃，流速1mL／min，流動相為甲醇：水＝75：25，檢測波長270 nm。

2.3 丹參醇提物中隱丹參酮和丹參酮IIA的含量測定 1）對照品溶液的制備：同2.2項下“對照品溶液的制備”。

2）供試品溶液的制備：取丹參醇提物約10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，濾過0.45μm濾膜，取續濾液即得。

3）色譜條件：Agilent SB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），柱溫25℃，流速1 mL／min，流動相為乙腈-0.026%磷酸水溶液，梯度洗脫，梯度設置如表1，檢測波長為270 nm。

表1 梯度洗脫表

2.4 響應面實驗設計

2.4.1 關鍵質量屬性（CQA）和關鍵工藝參數（CPP）的確定：目標成分隱丹參酮（Y1）和丹參酮IIA（Y2）的提取率作為CQA，乙醇濃度（A，80%～100%），乙醇倍量（B，6～12倍），煎煮時間（C，0.5～3小時）作為CPP。擬定工藝目標為隱丹參酮和丹參酮IIA的提取率分別大于70%和50%。

2.4.2 中心點復合設計 利用Design expert8.0軟件安排20次實驗（α值選擇1，中心點重復6次）。因素水平如表2所示。

表2 丹參醇提因素水平表（α＝1）

3 結果與討論

3.1 實驗結果

3.1.1 丹參藥材隱丹參酮和丹參酮含量測定結果本批次藥材中丹參中隱丹參酮含量為（2.9±0.00834）mg／g（n＝3），丹參酮IIA含量為（4.7±0.0221）mg／g（n＝3），藥材質量符合藥典要求。

3.1.2 提取率實驗結果 根據中心點復合實驗設計安排進行工藝操作，根據出膏率、丹參醇提物中隱丹參酮含量、丹參酮IIA含量計算隱丹參酮（Y1）、丹參酮IIA提取率（Y2），結果如表3。

表3 CCD實驗數據

表4 方差分析表-Y1

3.2 模型的建立及評價

3.2.1 模型的建立 采用二次多項式模型對兩個CQA（Y1，Y2）及相應的CPP（A，B，C）分別進行擬合，Y1和Y2的的回歸方程分別是：

二方程的擬合相關系數R2分別是0.7466和0.7595，表明響應值Y1和Y2實際值與預測值之間具有較好的的擬合度，因此可以使用此模型來預測隱丹參酮和丹參酮IIA提取率的實際情況。

3.2.2 方差分析 方差分析結果以Y1為例，如表4所示。

可以看出，對于Y1和Y2，模型的P值均小于0.05（顯著），且失擬值均大于0.1（不顯著），表明所建模型可靠，各因素與響應值之間的關系可以用此模型函數化。乙醇濃度A，乙醇倍量B，煎煮時間C的P值均小于0.05，表明A、B、C三個因素對Y1，Y2具有顯著影響，且影響程度排序均為A＞B＞C。但AB，AC，BC的P值均小于0.05，表明A、B、C三個因素的交互作用對Y1，Y2的影響不顯著。

3.3 響應面分析 以Y1為例，圖1為隱丹參酮的提取率隨乙醇濃度和乙醇倍量變化的響應面圖，圖2為隱丹參酮的提取率隨乙醇濃度和煎煮時間變化的響應面圖。

圖1 乙醇濃度和乙醇倍量對隱丹參酮（Y1）提取率影響的響應面圖

圖2 乙醇濃度和煎煮時間對隱丹參酮（Y1）提取率影響的響應面圖

由上圖可以直觀的看出，乙醇濃度A對于Y1和Y2的影響相比乙醇倍量B和煎煮時間C更大，與方差分析結果一致。在規定的范圍內，乙醇濃度越高，煎煮時間越短，有效成分的提取率就越高，這也符合了隱丹參酮和丹參酮IIA兩種醇溶性成分遇熱不穩定的特點［9］。

3.4 設計空間的建立 在設定的參數空間內搜索同時滿足兩個目標（Y1＞70%，Y2＞50%）的所有因素組合，即構成設計空間，結果用Overlay Plot展示，如圖3所示。

圖3 不帶有置信區間的丹參醇提工藝的設計空間

由圖3可以看出，白色部分即為丹參醇提工藝的設計空間，但由于模型的預測值與真實值之間存在一定差異，所以設計空間的邊界具有不確定性。為了應對設計空間邊界的不確定性，在定義設計空間時可加入置信水平α＝0.05的置信區間，將設計空間優化，結果應用Overlay plot展示，如圖4所示。

圖4 加入95%置信區間的丹參醇提工藝的設計空間

由圖4可以看出，白色部分即為優化后的設計空間，即整個空間內所有的點的估計值都符合工藝目標要求（Y1＞70%，Y2＞50%），深灰色部分屬于原有設計空間內不可靠的部分，即此空間內的估計值有5%的概率無法滿足原有的工藝目標要求。

3.5 驗證實驗 在圖4中選取5個不同區域內的的點來做驗證實驗，5點的選取如表5所示。驗證實驗結果如表6所示。

表5 驗證實驗點的選取

表6 設計空間驗證實驗結果

由驗證實驗結果可知，YZ1、YZ2和YZ5均符合預設要求。YZ3和YZ4中Y1＜70%，Y2＞50%，Y2均符合預設要求而Y1卻沒有達到，這表明由于95%置信區間的加入，相比未加入95%置信區間，設計空間邊界的不確定性得到了較好的印證。

4 結論

本文采用中心點復合設計對丹參醇提工藝進行優化，并構建了丹參醇提工藝的設計空間。加入95%置信區間后，設計空間的范圍有所縮小，提高了設計空間的可靠性。實驗結果表明，基于QbD理念建立丹參醇提設計空間可提高工藝過程的穩健性和可靠性。

［1］International Conference on Harmonisation，ICH Q8（R2）：Pharmaceutical Development，2009.

［2］Pisano R，Fissore D，Barresi A A，et al.Quality by design：optimization of a freeze-drying cycle via design space in case of heterogeneous drying behavior and influence of the freezing protocol［J］.Pharmaceutical Development and Technology，2013.18（1）：280-295.

［3］Martinez L，Antonio P，Lorenz L，etal.Use of near-infrared spectroscopy to quantify drug content on a continuous blending process：Influence of mass flow and rotation speed variations［J］.European Journal of Pharmaceutics，2013，84（3）：606-615.

［4］Defne Kayrak-Talay，Dale Steven，Wassgren Carl，et al.Quality by design for wet granulation in pharmaceutical processing：Assessing models fora prioridesign and scaling［J］.Powder Technology，2013，240：7-18.

［5］Teckoe Jason，Mascaro Tracey，Farrell Thomas P，et al.Process Optimization ofa Novel Immediate Release Film Coating System using QbD Principles［J］.AAPSPharmscitech，2013，14（2）：531-540.

［6］Streefland.M，Van Herpen PFG，Van deWaterbeemd B，etal.A practical approach for exploration and modeling of the design space of a bacterial vaccine cultivation process［J］.Biotechnol Bioeng，2009，104（3）：492-504.

［7］徐冰，史新元，喬延江，等.中藥制劑生產工藝設計空間的建立［J］.中國中藥雜志，2013，38（6）：924-929.

［8］徐冰，羅贛，林兆洲，等.基于過程分析技術和設計空間的金銀花醇沉加醇過程終點檢測［J］.高等學校化學學報，2013，34（10）：2284-2289.

［9］翟學佳.丹參藥材熱不穩定性考察及提取工藝優化［J］.中國醫院藥學雜志，2009，29（19）：1619-1622.

（2013-10-30收稿）

Establishment and Verification of Design Space of Ethanol Extraction Process of Salvia M iltiorrhiza based on Quality by Design

Luo Gan，Xu Bing，Liu Qian，Li Yang，Shi Xinyuan，Qiao Yanjiang
（Research Center of TCM information Engineering，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

Objective：To establish and verify the design space of ethanol extraction process of Salviamiltiorrhiza.Method：The extraction ratios of cryptotanshinone and Tanshinone IIA are identified as the critical quality attributes（CQAs），and ethanol concentration，ethanol amount，decoction time are identified as critical process parameters（CPPs）.The central composite design is used for experimental arrangements，and the design space of ethanol extraction process of Salviamiltiorrhiza is established based on the quadratic polynomial regressionmodel.Result：Since the p-values of bothmodels are less than 0.05 and values of lack of fit aremore than 0.1，the relationship between CQAs and CPPs could be well described by the twomodels.The reliability of design space，illustrated by overlay plot，is improved with the addition of 95%confidence.Conclusion：The robustness and flexibility of Salviamiltiorrhiza ethanol extraction process have been enhanced via the establishment of design space based on the quality by design（QbD）concept.

Quality by Design（QbD）；Salviamiltiorrhiza；Ethanol extraction process；Design Space；Process robustness

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.11.006

北京中醫藥大學自主選題項目“中藥提取物化學、物理屬性的全息快速評價研究”（編號：532／0100604295）；2013年省部級“中藥基礎與新藥研究”重點實驗室開放課題資助

羅贛（1986—），男，北京中醫藥大學中藥學院

喬延江，男，博士，教授，博士生導師，主要從事中藥信息學研究，北京市朝陽區北三環東路11號，郵編：100029，E-mail：yjqiao＠263. net；徐冰，博士，講師，研究方向為中藥制藥過程分析與控制，郵編：100102，E-mail：btcm＠163.com