維腦康干預大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的蛋白質組學研究

苗 蘭曹 進徐 立孫明謙劉建勛

（1中國中醫科學院西苑醫院基礎醫學研究所，中藥藥理北京市重點實驗室，北京，100091；2中國食品藥品檢定研究院，北京，100050）

維腦康干預大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的蛋白質組學研究

苗 蘭1曹 進2徐 立1孫明謙1劉建勛1

（1中國中醫科學院西苑醫院基礎醫學研究所，中藥藥理北京市重點實驗室，北京，100091；2中國食品藥品檢定研究院，北京，100050）

目的：應用LC-MS／MS蛋白質組學方法研究維腦康膠囊治療大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的作用機制。方法：大鼠分為正常對照組、模型對照組及維腦康膠囊組，取大鼠全血離心獲得血清，進行酶解，應用nano Chip-ESIIon Trap進行樣本分析，測定結果利用Agilent Spectralmill、scaffold及SIMCA P+等軟件進行蛋白鑒定、模式判別及蛋白相對定量分析。結果：最終比對出正常對照組、模型對照組和維腦康膠囊組的總蛋白數分別為833個、701個和798個，與正常對照組相比，模型對照組分析出的差異蛋白共18個，其中上調的是13個蛋白，下調的是5個蛋白，而在維腦康膠囊組中這些差異蛋白的表達均有所恢復，其功能分別與神經元凋亡、神經元生長與分化、信號通路及轉錄調控等過程密切相關。結論：維腦康膠囊治療局灶性腦缺血再灌注的作用機制可能與這些差異蛋白有關，為維腦康膠囊作用的分子機制研究提供了新思路。

維腦康；蛋白質組學；局灶性腦缺血再灌注

腦血管病是導致人類死亡的三大疾病之一，在全球范圍內，每年使460萬人死亡，中國也是腦卒中高發地區，據估計居民現患腦血管病600萬，每年新發生腦血管病130萬人，死亡近100萬人，因此，如何有效治療腦血管病已成為目前關注的熱點。中藥制劑在治療腦血管病方面具有獨特的優勢，維腦康膠囊（WNK）系由人參、銀杏葉等中藥組成的中藥復方，臨床研究表明，該藥對血管性癡呆（VaD）患者有明顯的改善作用［1］。前期的實驗研究表明WNK對化學損傷造成的小鼠獲得性、鞏固性及再現性記憶障礙均有改善作用［2］，可能通過下調過量的氨基酸釋放而起到腦保護作用［3］。但是，WNK的作用機制、具體的作用靶點尚不清楚。從蛋白質組學角度對中藥的多環節、多靶點調控作用進行研究，可從整體水平揭示中藥單方、復方的作用機制，闡明藥物作用的物質基礎。

本研究中，我們通過對正常、局灶性腦缺血再灌注模型大鼠及給予WNK治療大鼠進行血清蛋白質提取、分離、鑒定及數據比對，從整體上研究經WNK治療的局灶性腦缺血再灌注模型大鼠特有蛋白質的表達情況，可望從分子水平上探討WNK治療局灶性腦缺血再灌注的作用機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 儀器：Agilent 6340 Ion Trap（Chip -ESI源）；Agilent 1200 nano-LC（Chip），Agilent chemstaion色譜工作站（Agilent，USA）；METTLER TOLEDO AE240電子分析天平；注射泵KDS100CE購自KD Scientific公司；蛋白分析用Chip C18，150mm× 75μm（Agilent，USA）。

試劑：三羥甲基氨基甲烷Tris購自amresco，TCEP、胰蛋白酶Trypsin均購自Thermo，碘代乙酰胺IAA購自sigma公司，乙腈、丙酮分別為fisher、J.T.Braker公司產品，均為色譜純，甲酸購自J.T.Braker公司，為分析純，BCA試劑盒購自百泰克公司，實驗用水為娃哈哈純凈水。

1.2 方法

1.2.1 動物血清樣品的采集 前期采用線栓法建立局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，并給予中藥WNK進行治療，之后采集正常對照組、模型組及WNK組大鼠全血，每組各10只。每只大鼠采集2 mL血液，4℃放置30 min后，自然凝固，離心（3500 r／min，15 min）。取上清轉移至eppendorf管，離心（7500 r／min，30 min），取上清作為血清樣品，放入-80℃低溫保存。血清應用Bicinchoninic acid Protein Assays（BCA）法測定蛋白濃度。

1.2.2 樣品的處理 取50μL血清與3倍體積50 mmol／L Tris緩沖液混合，渦旋1 min，加入3倍體積-20℃預冷丙酮，渦旋1 min，4℃沉淀過夜，離心8000 r／min，15 min，4℃，取沉淀，使丙酮揮發完全，但不使樣品完全干燥，備用。

1.2.3 蛋白質酶解 混懸蛋白于50mM tris buffer pH8.5中，濃度大約1～3 mg／mL；活化Trypsin（50 mM濃度，tris溶液）后，以蛋白含量與胰蛋白酶液比例為20∶1加入酶液，37℃水浴3 h，每1小時渦旋1次，此為第一次消解；加入1 mM TCEP，37℃水浴30 min，放冷至室溫；進行烷基化，3μL IAA溶液對應10μg蛋白，37℃水浴20 min（避光）；第二次消解，以蛋白含量與酶液比例為30∶1加入酶液，37℃水浴過夜；終止反應，每50μL溶液加入2μL甲酸；離心，12000 r／min，4℃15 min，取上清液分析。

1.2.4 質譜及色譜條件 質譜條件：Scan Mode：Ultra Scan；Source：ESI-Chip；陽離子模式；Capillary：-1900V；Dry temp：300oC；Dry Gas：3.0 L／min；Skimmer：30V；Cap Exit：100V；Trap Drive：80.0；Smart Target：500000；Accu Time：200ms；MS／MS Frag Amp：l.0V；質量范圍：300～2000m／z，離子排除：5個前體離子；排除時間30s。

色譜條件：Chip：150mm 300A C18chip w／160nL trap column；進樣量：0.2μL；Pump1（nano pump）流動相：A相為97%水和3%乙腈溶液加甲酸至0.1%，B相為90%乙腈和10%水加甲酸至0.1%；流速：0.3 μL／min；線性梯度洗脫時間程序如下：起始3%B 0-70 min線性上升到45%，70-85 min線性上升到90%，85-95.01 min線性上升到100%，保持15 min，110-115 min下降至3%，持續10 min；運行時間：125 min。Pump2（Capillary pump）流動相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為90%乙腈和10%水加甲酸至0.1%；流速：3μL／min；線性梯度洗脫時間程序如下：起始0%B持續4 min；4-5 min線性上升到80%，持續5 min，10.01-85 min維持80%，流速為0μL／min，第85.01-95 min線性上升到100%，流速恢復至3μL／min，96 min降至0%；運行時間：125 min。

1.2.5 MS／MS數據搜索 應用Agilent chemstaion色譜工作站中DataAnalysis軟件進行圖譜分析；應用Excel2007及SPSS 12.0進行數據的統計學分析。

MS／MS數據分析應用的是Agilent Spectrum Mill軟件。參數設置：Database：Swissprot；Species：Rattus norvegicus；Digest：Trypsin；Maximum Missed cleavages：2；Fixed Modification：Carbamidomethylation（C）；Precursormass tolerance：+／-2.5Da；Productmass tolerance：+／-0.7；Filter peptides by Score＞6，SPI（scored peak intensity）＞50%；Filter by protein score＞11。

1.2.6 蛋白相對定量和功能聚類 應用scaffold3.0軟件進行蛋白數據處理、相對定量、蛋白定位和功能的聚類分析。肽段的鑒定要求其可能性在95%以上視為可信，而蛋白的鑒定要求其可能性在99%以上，同時匹配上的肽段必須有2個以上，假陽性率＜0.01%。相對定量的方法是采用累計譜圖計數的方法，即用鑒定的MS／MS譜圖總數來評價一個特定蛋白的豐度，對不同分組中的這個蛋白所檢測到的MS／MS譜圖總數進行歸一化后，再進行相對豐度的比較。在scaffold軟件中支持多組數據同時處理與統計學計算，本課題分為正常對照組、模型組和WNK組，共3組，因此統計學方法用的是適用于多組比較的ANOVA Test方法，P＜0.05。在上述參數設置及數據分析方法的前提下，再應用scaffold3.0軟件中GO注釋的功能進行蛋白質功能聚類分析。

2 結果

2.1 大鼠血清整體蛋白的發現 通過應用非標記液相色譜／質譜聯用技術進行WNK治療局灶性腦缺血再灌注大鼠作用機制的血清蛋白組研究，分別設立為正常對照組、模型組和WNK組，結合Spectrum Mill和scaffold軟件的搜索比對和分析，最終比對出正常、模型和WNK組的總蛋白數分別為833個，701個，798個。

圖1 大鼠血清蛋白組三維PCA圖

圖2 大鼠血清蛋白組OPLS-DA圖

2.2 大鼠血清蛋白組主成分和偏最小二乘法分析應用SIMCA P+12.0軟件進行蛋白組數據的模式判別和預測，針對不同的分組進行區別。研究中利用最終搜索出的蛋白進行比較，以獲得的正常對照組特異性蛋白為參照，對3組來源樣品進行了PCA和OPLSDA分析，將上述各組進行分類，各組聚類較好。如圖，在PCA圖和OPLS-DA圖中，結果可看出3組樣品呈現三角形分布，且各自聚類較顯著，彼此之間能夠得到較好的區分。

2.3 檢出蛋白功能總結 本研究應用scaffold3.0中GO注釋的功能，針對檢測到的蛋白進行了蛋白功能和蛋白定位的聚類分析。如下圖，檢測到的蛋白所涉及的生物學過程包括：應激反應、多細胞生物過程、代謝過程、定位、免疫系統過程、生物調控反應、發育過程、細胞過程等一系列生物學過程。而蛋白的定位大部分分布于細胞膜、線粒體、細胞器膜、胞質、細胞骨架、細胞內細胞器及細胞外區域等。而如圖4，檢測到的蛋白功能主要涉及分子功能、結合功能、分子信號轉導活性、酶調控活性及催化活性等。

圖3 大鼠血清檢出蛋白所涉及的生物學過程

圖4 大鼠血清蛋白組檢出蛋白的功能分類

圖5 經定量比較后的差異蛋白

2.4 差異蛋白及其功能分析 對于所檢測出的蛋白利用累積計數的方式，并應用Scaffold軟件進行了蛋白相對量的比較，蛋白改變在2倍以上視為差異蛋白（圖5）。分析出的差異蛋白共18個（表1、2），其中與正常對照組比較，模型組中上調的是13個蛋白，下調的是5個蛋白，而在WNK組中這些差異蛋白的表達有所恢復，說明藥物可能通過調控這些蛋白而起到了一定的治療作用。同時這些差異蛋白其功能特性分別與神經元凋亡、神經元生長與分化、信號通路及轉錄調控等過程密切相關。3 討論

序號ID 0.2 Tripartitemotif-containing protein 8 2 P29621 46766.3 7.69 Musmusculus SwissProt 22.52 Serine protease inhibitor A3C 3 A2CE44 90376.9 7.75 Musmusculus SwissProt 19.16 Zinc finger X-linked protein 4 Q921 I1 76724.3 6.94 Musmusculus SwissProt 28.92 Serotransferrin 5 Q99246 240139.8 6.45 Musmusculus SwissProt 26.37 Voltage-dependent L-type calcium channel subunit alpha-1D 6 Q9D9I4 45825.3 6.47 Musmusculus SwissProt 8.4 TBC1 domain familymember20 7 Q80YR4 99192.6 8.7 Musmusculus SwissProt 13.61 Zinc finger protein 598 8 Q6DID5 76069.5 8.75 Musmusculus SwissProt 9.23 PWWP domain-containing protein MUM1 9 Q8BGT6 94091.8 6.26 Musmusculus SwissProt 18.81 MICAL-like protein 1 10 Q8BKC8 91515.6 5.91 Musmusculus SwissProt 13.4 Phosphatidylinositol4-kinase beta 11 P11087 138033.1 5.65 Musmusculus SwissProt 31.6 Collagen alpha-1（I）chain 12 P25446 37418.1 8.42 Musmusculus SwissProt 15.34 Tumor necrosis factor receptor superfamilymember 6 13 P26618 122684 5.03 Musmusculus SwissProt 17.32 Alpha-type platelet-derived growth factor receptor 14 Q2TPA8 54208.7 6.31 Musmusculus SwissProt 11.54 Hydroxysteroid dehydrogenase-like protein 2 15 Q4VAC9 148572.8 5.5 Musmusculus SwissProt 23.74 Pleckstrin homology domain-containing family G member 3 16 P97792 39947.8 6.54 Musmusculus SwissProt 8.52 Coxsackievirus and adenovirus receptor homolog 17 Q8BSI6 65751.9 5.3 Musmusculus SwissProt 10.56 R3H and coiled-coil domain-containing protein 1 18 Q8VEG6 63023.7 6.1 Musmusculus SwissProt 14.63 CCR4-NOT transcription complex subunit分子量等電點種屬數據庫分值蛋白名稱1 Q99PJ2 61605.4 7.26 Musmusculus SwissProt 1 6-like

功能1 Tripartitemotif-containing protein 8序號蛋白名稱蛋白結合酶2 Serine protease inhibitor A3C絲氨酸型蛋白內切酶抑制劑3 Zinc finger X-linked protein正向調節核酸結合轉錄因子活性4 Serotransferrin細胞內鐵離子轉運，調節鐵離子平衡5 Voltage-dependent L-type calcium channel subunit alpha-1D G蛋白信號轉導，離子轉運6 TBC1 domain familymember 20細胞膜Rab GTP酶活性調節7 Zinc finger protein 598結合金屬離子蛋白8 PWWP domain-containing protein MUM1 DNA修復9 MICAL-like protein 1細胞骨架10 Phosphatidylinositol4-kinase beta高爾基體組成，核苷酸結合轉移酶活性11 Collagen alpha-1（I）chain成骨細胞分化，膠原蛋白合成，蛋白傳輸相關12 Tumor necrosis factor receptor superfamilymember 6腫瘤壞死因子，激活T細胞凋亡13 Alpha-type platelet-derived growth factor receptor血小板生長因子，正向調節成纖維細胞增值14 Hydroxysteroid dehydrogenase-like protein 2代謝過程相關15 Pleckstrin homology domain-containing family Gmember 3 Rho蛋白信號轉導調控16 Coxsackievirus and adenovirus receptor homolog反相調節心肌細胞增值17 R3H and coiled-coil domain-containing protein 1核酸結合受體活性相關18 CCR4-NOT transcription complex subunit6-like mRNA過程

本文應用液質聯用的蛋白質組學方法，在對WNK治療大鼠局灶性腦缺血再灌注的作用機制進行初步研究中，發現多種蛋白發生了明顯的變化，包括神經元凋亡相關蛋白、神經元生長與分化調控蛋白、炎癥相關蛋白等。

絲氨酸蛋白酶（serine proteases）是一個蛋白超家族，主要通過切割蛋白序列中精氨酸位點來發揮蛋白水解活性，目前研究的這類蛋白主要與凝血和溶栓功能有關［4］。除了在血液系統中存在，還有定位在中樞神經系統中的絲氨酸蛋白酶，現在研究較多的就是纖溶酶原激活劑（t-PA），尿激酶型纖溶酶原激活劑（u -PA）及凝血酶（thrombin）。它們在保持中樞神經系統內穩態的過程中起著關鍵作用。在生物系統中，絲氨酸蛋白酶的活性依賴于與其抑制劑的動態平衡，這些抑制劑充當著目標蛋白酶的假底物，與其催化位點形成緊密結合，通過減緩細胞外蛋白水解，來改變細胞外基質蛋白水解的過程，包括神經元遷移、成熟的突觸連接的形成等［5］。神經元性絲氨酸蛋白酶抑制劑（neuroserpin）在建立正常神經元連接體系中起著重要的作用，它能夠促進軸突和樹突的生長［6］。在腦缺血發生后，體內neuroserpin表達量上調可對大腦神經元及缺血損傷區形成保護作用。neuroserpin表達缺失的局灶性腦缺血中風模型大鼠腦梗死面積及腦損傷程度隨著neuroserpin的缺失越來越嚴重，t-PA活性不斷增加，能夠引起神經元興奮性中毒，血腦屏障的破壞，同時誘導小神經膠質細胞活性不斷增強，它們又共同促進了前炎癥反應的發生和加重；小神經膠質細胞通過對過氧化物、一氧化氮、TNF-α、谷氨酸鹽及金屬蛋白酶的釋放實現神經毒作用和血腦屏障的破壞，而t-PA又進一步促進了這些毒性作用的發生［7］。老年性癡呆（AD）患者腦內Aβ的異常沉積是神經元變性、丟失的重要原因。Aβ在凝集過程中可通過激活小膠質細胞和補體，釋放細胞因子和自由基等，誘發炎癥反應，促使tau蛋白異常磷酸化，導致神經元凋亡和壞死［8］，而有研究表明neuroserpin通過與Aβ相互作用，形成復合體，從而使Aβ變成非毒性的低聚物，因而實現了神經元保護作用［9］。

同源的Tumor necrosis factor receptor superfamily（TNFRSF）成員與TNF超家族結合可介導多種生物學功能。大部分TNFRSF成員及其TNFSF配基在大腦或神經系統的不同生理階段都有表達［10］。其在大腦中的表達是否保持平衡狀態對于多種神經功能是非常重要的，包括促進神經生長、分化、神經支配、促進感受性及樹突形成等［11-12］。一旦TNFSF／TNFRSF的功能或表達發生異常，在免疫反應缺失情況下，就會改變大腦的發展、功能及行為，表現為異常［13］。神經元、神經膠質細胞和少突膠質細胞的TNFSF／TNFRSF表達有所改變就會誘導細胞成熟、細胞壽命、形態學和功能發生變化，從而導致神經系統功能的改變［14］。伴隨著神經系統功能的改變，炎癥過程如神經炎性和免疫抑制又會進一步促使TNFSF／TNFRSF的表達上調，活性改變［15］。

Zinc finger X-linked protein（ZFX）是具有高度保守序列的鋅指轉錄因子，ZFX整個蛋白都編碼在X染色體上，包括酸性轉錄激活區，核定位序列及具有鋅指結構的DNA結合區域［16］。它是胚胎期和成熟期造血干細胞自我更新的轉錄調控因子，調控人類胚胎干細胞自我更新和分化達到一個平衡狀態［16］，有研究報道它與人類的神經膠質瘤、喉鱗狀細胞癌、前列腺癌及胃癌疾病過程中的細胞凋亡、細胞增殖及細胞周期有密切的關系，它可以影響AKT的激活［17-18］。在胃癌細胞系中他的表達明顯增加，進行基因敲除后可誘導細胞凋亡，增加Bax的表達，同時降低Bcl-2的表達；阻止細胞周期的進行，抑制細胞增殖，其機理是通過下調ERK-MAPK通路來實現的［19］。

本研究中，大鼠局灶性腦缺血再灌注模型組血清的蛋白表達輪廓與正常對照組相比，鑒定出Tripartite motif-containing protein 8、Serine protease inhibitor、Tumor necrosis factor receptor superfamily member等差異蛋白，而給予WNK治療后，這些差異蛋白呈現與模型組相反的變化趨勢，其表達情況與正常對照組較為接近。同時這些差異蛋白的功能特性分別與神經元凋亡、神經元生長與分化、信號通路及轉錄調控等過程密切相關，這與局灶性腦缺血再灌注發生、發展所涉及的病理過程相吻合，也與前期研究結果顯示的WNK具有改善認知、腦保護等藥理作用的實驗結果較吻合。因此，這些差異蛋白可能是WNK治療大鼠局灶性腦缺血再灌注作用的分子機制。本研究為我們今后進行深入研究提供了更多的信息和可能性，奠定了良好的工作基礎。

［12］Czeschik JC，Hagenacker T，Sch?fers M，et al.TNF-alpha differentially modulates ion channels of nociceptive neurons［J］.Neurosci Lett，2008，434（3）：293-298..

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［14］Keohane A，Ryan S，Maloney E，et al.Tumour necrosis factor-alpha impairs neuronal differentiation but not proliferation of hippocampal neural precursor cells：role of Hes1［J］.Mol Cell Neurosci，2010，43（1）：127-135.

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［18］Jiang H，Zhang L，Liu J，et al.Knockdown of zinc finger protein X-linked inhibits prostate cancer cell proliferation and induces apoptosis by activating caspase-3 and caspase-9［J］.Cancer Gene Ther，2012，19（10）：684-689.

［19］Wu S，Lao XY，Sun TT，etal.ockdown of ZFX inhibits gastric cancer cell growth in vitro and in vivo via downregulating the ERK-MAPK pathway［J］.Cancer Lett，2013，337（2）：293-300.

（2013-09-12收稿）

Proteom ics Study of the Therapeutic Effect of W einaokang on Rats Undergoing Focal Cerebral Ischem ia-Reperfusion Injury

Miao Lan1，Cao Jin2，Xu Li1，Sun Mingqian1，Liu Jianxun1
（1 Institute of Basic Medical Sciences of Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing key Laboratory of pharmacology of Chinesemateriamedica，Beijing 100091，China；2 Traditional Chinese Medicine Pharmacology，Beijing Key Laboratory，Beijing 100091，China；3 National Institute of Food and Drug Control，Beijing 100050，China）

Objective：To investigate themoleculemechanism ofWeinaokang in treatmentof the ratswith focal cerebral ischemia reperfusion by using LC-MSMSmethod.Methods：Global proteomics analysis had been conducted on serum samples collected from normal group，model group，and Weinaokang treatment group.After digestion，the sampleswere detected by applying nano Chip-ESI Ion Trap. Protein identification，pattern discrimination and relative quantitative analysiswere determined using Agilent Spectralm ill、scaffold 3 and SIMCA P+software.Results：833，701and 798 proteinswere found on healthy group，modelgroup，and TCM treatmentgroup respectively.Compared with healthy group，18 changed proteins had been determined：13 proteins up-regulated，5 proteins down-regulated in model group，and these differential proteins had converse tendency in TCM treatment group.Current studies also aim at themajor functional classification of proteins betweenmodel and health groups，aswell asmodel and treatmentgroups.The biological function of these changed proteins were closely related to growth and differentiation of neurons，neuronal apoptosis，signal transduction and regulation of translation，etc.Conclusion：Themoleculemechanism ofWeinaokang capsule for treating focal cerebral ischemia reperfusionmay be associated with different proteins，and itwill provide a new idea for study ofmoleculemechanism ofWeinaokang capsule.

Weinaokang；Proteomics；Focal cerebral ischemia reperfusion

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.10.003

科技部十二五重大新藥創制課題（編號：2012ZX09301002-004）；科技部國際合作項目（編號：2011DFA31440）；北京市“十病十藥”研發（編號：Z121102001112006）

劉建勛，男，研究員，博士生導師，主要從事心腦血管藥理學研究，Tel：010-62835601，E-mail：liujx0324＠sina.com