降鈣素基因相關肽經鼻靶向中樞給藥的實驗研究＊

孫樹印 吳慶建 閆承軍 焦 華

（濟寧醫學院附屬濟寧市第一人民醫院，山東 濟寧272011）

降鈣素基因相關肽（calcitonin gene－related peptide，CGRP）是目前體內已知的最強的舒血管活性肽，分為α型和β型，由37個氨基酸殘基組成，廣泛分布于神經及心血管系統，參與機體許多功能的調節，與多種疾病有著密切關系。研究發現其對腦血管的發生和防治中有重要意義，如腦梗死、蛛網膜下腔出血等有著潛在的治療作用。CGRP的分子量為3786.91KDa，其大分子特性使其經靜脈給藥無法透過血腦屏障到達中樞神經系統起到治療作用。迄今為止臨床缺乏一種合理有效的靶向中樞的給藥途徑。近年來很多學者研究發現，經鼻給藥是一種新的中樞神經系統給藥途徑，我們設計實驗，將CGRP經鼻靶向中樞給藥，采用酶聯免疫吸附法（Enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）測定大鼠腦內各分區CGRP的濃度，研究CGRP經鼻靶向中樞給藥的可行性。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物模型及分組 健康成年Sprague－Dawley大鼠，雄性，體重230～270g，共24只，提供單位（山東魯抗實驗動物中心），將動物置于實驗動物房，室溫（23±1）℃，自由飲水進食。制作大鼠大腦中動脈閉塞（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）缺血模型，造模成功后，將模型隨機分為對照組（不予任何干預）、靜脈注射CGRP組（IV CGRP組）50μg／0.5ml、經鼻給予媒介液組、經鼻給予CGRP（IN CGRP組）50μg／50μl，每組各6只MCAO大鼠，采用ELISA測定大鼠腦各分區中的CGRP濃度。

1.1.2 主要試劑和儀器 CGRP購自美國SIGMA公司，CGRP濃度檢測采用武漢中美科技有限公司ELISA試劑盒；美國Bio－Rad酶標；4－0單股尼龍線購自強生公司。JA－31001型電子分析天平（上海天平儀器廠），微量注射器（無錫東風玻璃儀器廠）。

1.2 實驗方法

1.2.1 MCAO模型 參照Zea等［1］的MCAO栓線模型制作方法，部分加以改良。麻醉方法采取10%水合氯醛（350mg／kg）腹腔注射，取頸前正中切口，依次暴露右側頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈。在右頸總動脈與右側頸內動脈起始部，插入1根4－0尼龍線（頂端用火燒圓的，避免刺破動脈，造成蛛網膜下腔出血），即可閉塞大腦中動脈，插入深度為18mm左右。

1.2.2 給藥方法 1）經鼻給藥（IN給藥）：大鼠處于麻醉狀態，固定四肢，取仰臥位，并將頭頸背稍稍墊高，以利于藥物進入后鼻腔。兩側鼻孔交替給藥，經鼻給予50μl CGRP或媒介液，間隔時間為5min，單次給藥劑量為10μl，共需25min左右。2）經靜脈給藥：經大鼠尾靜脈注射0.5ml CGRP或媒介液。

1.2.3 ELISA檢測 給藥結束后30min，過量麻醉處死大鼠后，取完腦脊液后，斷頭取腦，分別取嗅球、皮質、海馬、橋腦、頸髓，電子天平稱重，置于－85℃低溫冰箱中備用。按w：v（g：ml）＝1∶20的比例加入勻漿液進行組織勻漿，將勻漿液15 000 r／min離心30min，完畢后取上清液。ELISA測定方法嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3 統計學方法

實驗結果采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析（兩兩比較比較采用LSD法），P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

IV和IN給予CGRP后在大鼠腦部各分區的濃度變化。由表1可知，IV給藥組腦部CGRP濃度最高處為嗅球處（836.3pg／g），其次為腦脊液（810.5pg／g）。IN給藥組CGRP濃度最高的部位為嗅球（3536.3pg／g），其次為腦脊液（2895.6pg／g）。對4組大鼠腦部CGRP進行方差分析發現，IN CGRP組中CGRP在大腦腦部各分區的濃度均明顯高于其他各組，差異有統計學意義（P＜0.05）；對照組、IV CGRP組和IN NS組CGRP在各腦部分區均無統計學意義。

表1 不同途徑給予CGRP后各腦區CGRP濃度變化（±s，pg／g）

表1 不同途徑給予CGRP后各腦區CGRP濃度變化（±s，pg／g）

a：表示與對照組比較，P＜0.05；b：表示與CGRP組比較，P＜0.05；c：表示與IN NS組比較，P＜0.05。

分組 嗅球 皮質 海馬 橋腦 頸髓 腦脊液對照組 537.9±64.5 463.4±50.9 500.5±36.9 495.3±42.9 469.3±36.9 525.6±46.8 IV CGRP組836.3±126.4 657.8±126.7 689.6±89.7 756.6±96.9 698.6±115.8 810.5±110.9 IN NS組 495.6±64.5 457.6±62.9 510.3±45.8 479.6±42.9 482.3±40.9 530.4±53.3 IN CGRP組3536.3±637.5abc 2108.4±365.9abc 2600.4±425.9abc 1897.5±300.7abc 2346.7±369.8abc 2895.6±425.7abc F值 119.494 97.305 129.575 104.811 128.155 158.3 31 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

CGRP是一種與降鈣素基因同源的生物活性多肽，1983年Rosenfeld等采用用DNA基因重組和分子生物技術研究發現，組成結構為2800個堿基對，分子量3786.91。人和鼠的CGRP具有相近似的生物活性，含α和β兩種基因，分別表達兩種分子異構肽，分別由11號染色體上兩個相互獨立的基因編碼［2］，在第3、22、25位氨基酸組成有所不同。CGRP是目前研究發現效果最強的舒血管活性肽，作為神經遞質廣泛存在于中樞和周圍神經系統內，特別是感覺神經元的胞體和末梢內［3］。CGRP可能是神經系統對損傷反應的一種重要的保護性因素，當缺氧、缺血等因素引起神經元損傷時，CGRP在神經元的分布和表達的量發生改變。Wang S等［4］研究提示CGRP可能通過上調Bcl－2的表達對減輕腦缺血—再灌注腦組織的損傷有顯著作用。張璐等［5］制作大鼠全腦缺血再灌注模型，經頸動脈直接注入CGRP，采用腦組織切片染色的方法觀察CGRP對腦組織神經細胞缺血性損傷的影響，研究發現CGRP對缺血后海馬CA1的錐體細胞產生保護作用。由于血腦屏障的阻隔，加之CGRP大分子特性，外周給藥時很難通過血腦屏障到達中樞神經系統。直接注射到側腦室及大腦實質，由于手術具有創傷性、術后并發癥以及費用偏高等多種原因，臨床不能廣泛應用。因此，外源性的CGRP如何能有效地遞送至中樞神經系統，目前尚處于探索階段。

經鼻給藥作為新發現的靶向中樞神經系統給藥途徑，已引起神經病學研究領域眾多學者的關注。鼻是呼吸器官又是嗅覺器官，根據功能及組織結構的不同可分為3個區域：鼻前庭、嗅區和呼吸區。鼻前庭幾乎無吸收功能，呼吸區黏膜富含毛細血管，血流豐富，藥物由此吸收進入體循環；嗅區位于上鼻甲，面積約10cm2，緊貼篩板之下，藥物可由此吸收進入腦脊液，從而進入中樞神經系統。當IN給藥后，藥物通過嗅區吸收，則可以避開BBB阻礙，進而廣泛分布于CNS內。雖然眾多的實驗研究［6－9］結果表明，蛋白多肽類藥物經鼻靶向給藥可以到達中樞神經系統，但經鼻靶向中樞給藥的具體機制仍然不是很清楚，目前認為可能存在兩種途徑：1）嗅神經通路［10－11］；2）細胞外途徑［12－13］。本實驗采取ELISA檢測大鼠腦組織中CGRP濃度，操作方法簡單方便，具有很高的靈敏度及特異性。實驗結果表明，IN靶向中樞給予CGRP后，于靜脈給藥組和對照組相比，腦各分區的濃CGRP度顯著升高，證實了IN靶向中樞給予CGRP的途徑可避開血腦屏障的阻礙，且優于IV途徑。

經鼻靶向中樞遞送CGRP的方法具有中樞靶向性強、方便、無創傷性的特點，藥物可以迅速到達CNS，起到治療作用的同時避免了全身用藥可能帶來的副作用。因此，經鼻靶向中樞遞送CGRP的方法可能為一條有效的治療腦缺血損傷或其他CNS疾病的新途徑，至于CGRP經鼻給藥避開血腦屏障直接進入CNS的確切轉運機制尚有待進一步闡明。

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