金銀花和野菊花乙醇提取物抑菌作用比較

楊海霞 張孝俠 程曉平 翟景花 方召陽

（濟寧醫學院法醫學與醫學檢驗學院，濟寧 山東272067）

金銀花，為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾，具有清熱解毒、涼風散熱的功效，其主要有效成分為綠原酸，有抗菌消炎的作用［1］。野菊花系菊科植物野菊、北野菊或巖香菊的干燥頭狀花序［2］，具有清熱解毒、疏風平肝之功效，在我國民間藥用歷史悠久，中國藥典（2005年版）收載其栓劑用于抗菌消炎［3］。近年來，國內外學者運用現代理論知識做了大量的臨床藥理工作，從中醫科學的角度證實了金銀花、野菊花具有廣譜抗菌的藥理作用，本實驗通過對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌的體外抑菌試驗的研究，了解金銀花、野菊花的抗菌效果，并對其進行比較，從而為臨床合理用藥提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 金銀花葉采于濟寧醫學院盆景園；野菊花采于濟寧市動植物園。

1.1.2 菌株 金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、大腸桿菌（ATCC8099）、枯草桿菌（ATCC9372）標菌株由濟寧醫學院醫學檢驗實驗室凍存。

1.1.3 試劑 牛肉浸膏、蛋白胨、氯化鈉、營養瓊脂粉、蒸餾水、生理鹽水、無水乙醇

1.1.4 儀器 數顯電熱培養箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠 型號HPX－9272MBE）；電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；立式電熱壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠 型號LDZX－30FB）；旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠型號RE－52AA）；恒溫水浴鍋

1.2 方法

1.2.1 金銀花乙醇提取物的制備 將采集的金銀花用蒸餾水沖洗干凈，然后放到干燥箱中烘干、粉碎。取9.7g金銀花用無水乙醇浸泡過夜，用恒溫水浴鍋加熱回流，倒出濾液后，殘渣繼續用無水乙醇浸泡過夜，重復操作兩次。用旋轉蒸發器將濾出的液體濃縮至生藥含量為492mg／ml。

1.2.2 野菊花乙醇提取物的制備 將采集的野菊花用蒸餾水沖洗干凈，然后放到干燥箱中烘干、粉碎。取50g野菊花用無水乙醇浸泡過夜，用恒溫水浴鍋加熱回流，倒出濾液后，殘渣繼續用無水乙醇浸泡過夜，重復操作兩次。用旋轉蒸發器將濾出的液體濃縮至生藥含量為1035mg／ml。

1.2.3 培養基的制備 取營養瓊脂粉9g于三角燒瓶中，加蒸餾水200ml，用酒精燈加熱使其全部溶解，經121℃高壓滅菌20min，然后分裝到無菌平皿和試管中，制成平板培養基和斜面培養基，冷卻后4℃冷藏備用。

1.2.4 配制營養肉湯 取蛋白胨2.002g、牛肉浸膏1.005g、氯化鈉1.003g于三角燒瓶中，加100ml的蒸餾水，搖晃使其全部溶解，用2mol／L的Naoh調pH至7.2，經121℃高壓蒸汽滅菌30min，冷卻后4℃冷藏備用。

1.2.5 3種細菌繁殖體懸液的制備［4］分別取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌冷凍菌株管，室溫使其融化分散。取含5.0～10.0ml營養肉湯培養基試管，滴入少許菌種懸液，置37℃培養18～24h，分別用接種環取第1代培養的菌懸液，劃線接種于營養瓊脂培養基平板上，于37℃培養18～24h，挑取第2代培養物中的典型菌落，接種于營養瓊脂斜面，于37℃培養18～24h，即為第3代培養物。然后用5ml的稀釋液將第3代營養瓊脂培養基斜面新鮮菌苔洗下，制備成初步的菌懸液，再進行系列稀釋，制成含菌量為5×105～5×106cfu／ml的實驗菌懸液。

1.2.6 濾紙片的制備 將定性濾紙用打孔器制成6mm直徑的圓片，經121℃高壓蒸汽滅菌20min后，干燥保存備用。

1.2.7 抑菌環的測定 在無菌營養瓊脂平板表面分別均勻涂抹3種實驗菌懸液并置室溫干燥5min，然后在每個平板表面周邊距中心25mm等距離貼4片4層濾紙片，中心貼1片4層濾紙片，其中周邊4片加20μl金銀花乙醇提取物，中間1片加20μl無水乙醇作為陰性對照，然后將其置于37℃溫箱培養24h，觀察結果。用數顯游標卡尺測量抑菌環的直徑（包括貼片）并記錄測量數據。重復試驗4次。用同樣的方法做野菊花乙醇提取物抑菌環的測定。

判定標準：以抑菌環直徑大于8mm者判為有抑菌作用，抑菌環小于或等于8mm者判為無抑菌作用，4次重復試驗均達到有抑菌作用者，判為合格。陰性對照組應無抑菌環產生，否則實驗無效。

1.2.8 金銀花與野菊花乙醇提取物對3種細菌的最低抑菌濃度測定 將金銀花乙醇提取物倍比稀釋成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256 8個濃度各2.5ml，并設不含藥物的雙倍營養肉湯培養基作陽性對照。然后向各管中分別加入配好的菌懸液（金黃色葡萄球菌）100μl，混勻后放入37℃培養箱中培養，48h后確定是否有細菌生長。大腸桿菌、枯草桿菌的最低抑菌濃度測定方法同金黃色葡萄球菌。以藥物抑制細菌生長的最低濃度為最小抑菌濃度（MIC）。

野菊花乙醇提取物對3種細菌的最低抑菌濃度測定方法同上。

2 結果

2.1 金銀花乙醇提取物抑菌試驗結果

實驗結果表明，生藥含量為492mg／ml的金銀花乙醇提取物，在營養瓊脂平板上對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌的抑菌環直徑均大于8mm，顯示出良好的抑菌效果，而對大腸桿菌的抑菌環直徑小于8mm，說明對其無抑菌作用。見表1。

表1 金銀花乙醇提取物抑菌環試驗結果

2.2 野菊花乙醇提取物抑菌試驗結果

實驗結果表明，生藥含量為1035mg／ml野菊花乙醇提取物，在營養瓊脂平板上對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌環直徑均大于8mm，顯示出良好的抑菌效果，而對枯草桿菌的抑菌環直徑小于8mm，說明對其無抑菌作用。見表2。

表2 野菊花乙醇提取物抑菌環試驗結果

2.3 金銀花與野菊花乙醇提取物對三種細菌的最低抑菌濃度測定

見表3、表4。

表3 金銀花乙醇提取物不同稀釋度抑菌效果測定

表4 野菊花乙醇提取物不同稀釋度抑菌效果測定

由表3可見金銀花乙醇提取物對金黃色葡萄球菌和枯草桿菌抑菌作用較強，兩種菌的最低抑菌濃度皆為30.75mg／ml，對大腸桿菌的最低抑菌濃度為123mg／ml。

由表4可見野菊花乙醇提取物對大腸桿菌抑菌作用最強，最低抑菌濃度為16.17mg／ml；對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為對枯草桿菌的最低抑菌濃度為64.69mg／ml；對枯草桿菌的抑菌作用最弱，最低抑菌濃度為258.75mg／ml。

由表1、2、3、4可見，金銀花乙醇提取物對金黃色葡萄球菌和枯草桿菌作用最強，對大腸桿菌作用最弱；野菊花乙醇提取物對大腸桿菌作用最強，金黃色葡萄球菌次之，對枯草桿菌作用最弱。

3 討論

現代藥理研究表明，金銀花內含有豐富的木草黃素、肌醇、皂苷、鞣酸等有效成分，因為它們含有大量的還原基因，所以對多種致病菌有抑制作用。由表1的抑菌環試驗的測定結果可見，金銀花乙醇提取物對革蘭陽性菌（金黃色葡萄球菌、枯草桿菌）有明顯的抑菌作用，而對革蘭陰性菌（大腸桿菌）則沒有抑菌作用。管仲瑩等［5］人研究發現金銀花提取物具有一定的抑菌作用，與本試驗中的抑菌范圍較接近，這可能與金銀花提取物的工藝及質量、產地有關。

革蘭陽性菌與革蘭陰性菌的細胞壁結構顯著不同，革蘭陽性菌細胞壁較厚，肽聚糖層可達50層，革蘭陰性菌細胞壁較薄，肽聚糖層僅有1～2層，使兩者在抗原性及藥物敏感性方面有很大的差異。本試驗結果表明金銀花乙醇提取物具有很強的破壞細菌細胞壁的肽聚糖層的能力，進一步說明了其抑制細菌生長的作用很強。

現代藥理研究表明，野菊花含有揮發油，具有廣譜的抗菌作用。現有研究認為揮發油是菊花發揮抑菌作用的物質基礎，其中的樟腦、龍腦是其發揮抑菌作用的主要成分［6］。由表2的抑菌環試驗的測定結果可見，野菊花乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌有明顯的抑菌作用，而對枯草桿菌則沒有抑菌作用。曾帥等［7］人研究發現野菊花水煎液對多種細菌均有較強的抑菌作用，與本試驗中的抑菌范圍較接近，這可能與野菊花的提取方式不同有關。有報道顯示［8］，相同的中藥采用不同的提取方式，其提取物的抑菌活性會有顯著差別。

本次實驗所用的是乙醇萃取劑，而乙醇本身的抑菌作用不能忽視，尤其是本次實驗藥物稀釋前后抑菌環直徑不是成比例的縮小，在一定程度上體現出了乙醇是本次實驗的一個重要影響因素。但乙醇易揮發，作用不穩定，所以在一般的實驗中很少涉及關于乙醇的空白實驗。近年來中藥提取物對細菌的抑制作用研究較多，而中藥抑菌作用的研究也是開發利用中藥資源的一個重要組成部分。本實驗只是對金銀花和野菊花進行了粗提，因此，不能確定到底是哪種具體成分具有抑菌作用。下一階段的研究任務是采用不同的分離方法分離金銀花和野菊花的具體成分，以便確定到底是哪種成分具有抑菌作用。

［1］ 任愛農，王志剛，盧振初，等.金銀花抑菌和抗病毒作用實驗研究［J］.藥物生物技術，1999，6（4）：241.

［2］ 南京中醫藥大學.中藥大辭典［M］.2版.上海：上海科學技術出版社，2006：2144.

［3］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2005年版［M］.一部.北京：化學工業出版社，2005：596.

［4］ 消毒產品檢驗消毒技術規范［S］.北京：中華人民共和國衛生部，2002：83－93.

［5］ 管仲瑩，趙金明，林巧智.金銀花提取物抑菌作用的實驗研究［J］.遼寧省中醫藥研究院，2009，47（15）：150－152.

［6］ 張清華，張玲.菊花化學成分及藥理作用的研究進展［J］.食品與藥品，2007，2：60－63.

［7］ 曾帥，王子壽，賈俊.野菊花水煎液體外抗菌作用實驗研究［J］.中國中醫急癥，2008，7（17）：971.

［8］ 高靜，龍偉.中藥提取技術的研究進展［J］.醫學導報.2007，26（9）：1058－1060.