青心酮對兔動(dòng)脈粥樣硬化血管細(xì)胞黏附因子－1蛋白表達(dá)的影響

王 琳 劉同美 張代娟 劉江月

（濰坊醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，山東 濰坊261053）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種多因素相互作用引起的一類血管慢性炎癥性疾病［1］，其形成過程和發(fā)病機(jī)制至今尚未被完全闡明。活血化瘀中藥成分青心酮（3，4－dihydroxy－acetophenone，3，4－DHAP）在臨床用于冠心病、妊高征均獲得較好的臨床效果［2－3］。本實(shí)驗(yàn)旨在研究DHAP對AS病變中VCAM－1表達(dá)的影響，探討DHAP對AS的防治機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型與分組

18只新西蘭大白兔，♂，（體重2.0～2.5kg，12周齡），常規(guī)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組：常規(guī)飼料組、膽固醇飼料組和DHAP組，每組6只。膽固醇飼料組給予高脂飲食（配方為：83.5%常規(guī)飼料，8%豬大油，7.5%蛋黃粉，1%膽固醇），青心酮組除高脂飲食外，給予DHAP（10mg／kg），常規(guī)飼料組做對照組。喂養(yǎng)至12周末處死。

1.2 血脂檢測和體重測量

0周和12周末耳緣靜脈取血，離心后取血清，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀測定TC、TG、LDL。抽血前測量體重。

1.3 組織形態(tài)學(xué)觀察

12周末處死動(dòng)物，迅速分離出主動(dòng)脈，選取主動(dòng)脈約1.5cm，10%中性福爾馬林溶液固定24h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片機(jī)上制成5μm厚的連續(xù)切片，每組50張，每間隔6張取1張，行HE染色，光鏡下觀察組織學(xué)形態(tài)。

1.4 免疫組織化學(xué)分析

采用ABC法進(jìn)行組織染色，一抗采用抗兔VCAM－1多克隆抗體（購于武漢博士德生物科技有限公司）。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片后在顯微鏡下觀察。應(yīng)用Motic Images Advenced 3.2圖像分析軟件計(jì)算陽性細(xì)胞百分比，求平均值。

1.5 Western blot法檢測VCAM－1蛋白表達(dá)

取主動(dòng)脈約1cm加入裂解液，冰浴狀態(tài)下提取蛋白，12%SDS－PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉60min，一抗4℃過夜，TBST沖洗5min，共3次，堿性磷酸酶標(biāo)記二抗37℃60min，TBST沖洗3次，每次5min，ECL法顯色，圖像分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

全部數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以±s表示。自身比較采用配對t檢驗(yàn)，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。顯著性水平α＝0.05，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血脂及體重變化

實(shí)驗(yàn)前各組血清TC、TG、LDL、體重均無明顯差異（P＞0.05）；12周后3組動(dòng)物體重明顯增加，但組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；12周后常規(guī)飼料組TC、TG、LDL無明顯變化（P＞0.05），膽固醇飼料組和DHAP組血清TC、TG、LDL較12周前明顯升高（t值分別為9.02、4.609、13.267，P＜0.05），TG較12周前無明顯變化（P＞0.05），DHAP組TC、TG、LDL較膽固醇飼料組明顯下降（t值分別為6.004、19.007、28.004，P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)前后各組動(dòng)物血脂水平（±s，n＝6）

表1 實(shí)驗(yàn)前后各組動(dòng)物血脂水平（±s，n＝6）

注：與實(shí)驗(yàn)前血脂比較，＊表示P＜0.05；試驗(yàn)后膽固醇組與DHAP組血脂比較，△表示P＜0.05

組別實(shí)驗(yàn)前 實(shí)驗(yàn)后TC（mmol／L） TG（mmol／L） LDL（mmol／L） TC（mmol／L） TG（mmol／L） LDL（mmol／L）6±0.09 0.53±0.03膽固醇飼料組 1.03±0.11 0.66±0.08 0.53±0.05 42.66±6.39＊ 0.87±0.05＊ 7.39±0.08＊DHAP組 1.00±0.11 0.63±0.05 0.55±0.03 22.20±5.36＊△ 0.41±0.038＊△ 4.69±0.21常規(guī)飼料組 1.02±0.12 0.69±0.05 0.54±0.03 1.01±0.13 0.6＊△

2.2 組織形態(tài)學(xué)改變

光鏡下見膽固醇飼料組內(nèi)膜增厚多處形成較大斑塊，可見較多泡沫細(xì)胞。DHAP組內(nèi)膜也增厚，但較膽固醇組明顯減輕。常規(guī)組無上述表現(xiàn)。結(jié)果見圖1。

圖1 各組動(dòng)物主動(dòng)脈橫斷面HE染色病理切片（400×）

2.3 免疫組織化學(xué)分析

膽固醇飼料組、DHAP組內(nèi)膜和中膜VCAM－1陽性細(xì)胞含量明顯高于常規(guī)飼料組（t值分別為11.724、8.665，P＜0.05），DHAP組與膽固醇飼料組相比陽性細(xì)胞含量明顯下降（t＝3.830，P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組動(dòng)物主動(dòng)脈壁VCAM－1陽性細(xì)胞百分比（±s，n＝6）

表2 各組動(dòng)物主動(dòng)脈壁VCAM－1陽性細(xì)胞百分比（±s，n＝6）

注：高脂飼料組、DHAP組與常規(guī)飼料組比較，＊表示P＜0.05；DHAP組與高脂飼料組比較，△表示P＜0.05

VCAM－1常規(guī)飼料組組別3.54±0.55高脂飼料組 30.14±5.53＊DHAP組 19.12±4.37＊△

2.4 主動(dòng)脈VCAM－1蛋白表達(dá)

與常規(guī)飼料組相比，膽固醇飼料組VCAM－1、DHAP組表達(dá)明顯增多（t值分別為20.068、3.652，P＜0.05）。DHAP組與膽固醇飼料組相比VCAM－1表達(dá)明顯減少（t＝14.697，P＜0.05）。結(jié)果表3、圖2。

表3 各組動(dòng)物主動(dòng)脈壁VCAM－1蛋白表達(dá)量分析（±s，n＝6）

表3 各組動(dòng)物主動(dòng)脈壁VCAM－1蛋白表達(dá)量分析（±s，n＝6）

注：高脂飼料組、DHAP組與常規(guī)飼料組比較，＊表示P＜0.05；DHAP組與高脂飼料組比較，△表示P＜0.05

VCAM－1常規(guī)飼料組組別0.09±0.03高脂飼料組 0.79±0.08＊DHAP組 0.19±0.06＊△

圖2 DHAP對各組主動(dòng)脈VCAM－1蛋白表達(dá)影響

3 討論

血管細(xì)胞黏附因子－1（vascular cell adhesion molecule－1，VCAM－1）在內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及白細(xì)胞僅有少量表達(dá)，是一種介導(dǎo)細(xì)胞間、細(xì)胞與胞外基質(zhì)間黏附與相互作用的膜表面蛋白。90年代初有人發(fā)現(xiàn)在兔AS模型平滑肌中VCAM－1表達(dá)含量較高［4］，隨后大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都發(fā)現(xiàn)在AS病變區(qū)域的粥樣斑塊中有VCAM－1的大量表達(dá)。90年代，Hackman在對大量血脂紊亂患者VCAM－1水平測定過程中發(fā)現(xiàn)，VCAM－1在膽固醇增高和甘油三酯增高的患者中增加尤為明顯［5］。以上這些證據(jù)統(tǒng)統(tǒng)表明，VCAM－1在AS發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色。

AS是一種慢性炎癥疾病，內(nèi)皮細(xì)胞受損以及單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附是AS形成的關(guān)鍵。單核細(xì)胞在黏附分子作用下?？坑谘鼙?，在趨化因子促進(jìn)下進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞。血脂紊亂、高血壓等都可作為損傷因子損傷血管內(nèi)皮，導(dǎo)致LDL滲入并積聚于內(nèi)皮下氧化為ox－LDL，其中某些脂類與細(xì)胞受體結(jié)合后激活基因表達(dá)，促使內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)大量黏附分子，使血流中的單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞黏附于受損內(nèi)皮表面，單核細(xì)胞在單核細(xì)胞趨化蛋白－1（MCP－1）作用下遷移入內(nèi)皮下，攝取ox－LDL轉(zhuǎn)化為激活的巨噬細(xì)胞，成為泡沫細(xì)胞［6］。通過抑制VCAM－1來阻止單核細(xì)胞與內(nèi)皮黏附有望為成為AS預(yù)防的新靶點(diǎn)。

DHAP，又名3，4－二羥基苯丙酮，是具有活血化瘀作用中藥禿毛冬青葉的有效成分，在臨床用于冠心病、妊高征均獲得了較好的臨床效果，大量中藥藥理學(xué)研究顯示，DHAP對擴(kuò)張血管，抑制血管平滑肌增殖等也有較好的效果［2］。DHAP還可通過抑制炎癥因子如TNF－α、COX－2發(fā)揮抗炎作用。

本試驗(yàn)通過高膽固醇血癥建立了兔AS模型，經(jīng)過12周的高脂飼料喂養(yǎng)后，各組兔均出現(xiàn)了不同程度的高脂血癥。通過對各組主動(dòng)脈壁HE染色觀察發(fā)現(xiàn)高脂飼料組與DHAP組均出現(xiàn)了大小不同的斑塊，證明本次試驗(yàn)成功復(fù)制出AS模型。本次研究發(fā)現(xiàn)DHAP對AS中斑塊大小、血脂水平以及VCAM－1含量均有很大影響，本文結(jié)果顯示DHAP對兔的血脂有抑制作用，DHAP組中的TC、TG、LDL水平較高脂飼料組明顯下降，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。大量循證醫(yī)學(xué)都表明AS嚴(yán)重程度隨血脂水平升高呈線性加重。本文結(jié)果也顯示DHAP顯著降低了AS病變區(qū)域VCAM－1表達(dá)，大量研究表明，VCAM－1的表達(dá)與AS嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，即隨著AS斑塊的增大其表達(dá)越多，通過本次研究使得VCAM－1與AS嚴(yán)重程度的研究更加具有說服力［7］。本實(shí)驗(yàn)表明DHAP可抑制兔AS模型VCAM－1過度表達(dá)，并使粥樣斑塊縮小，表明VCAM－1參與了AS的形成過程。DHAP除具有降脂作用以外，還具有抑制VCAM－1的表達(dá)，可能是其抗AS的機(jī)制之一。然而這些有益的影響的確切機(jī)制尚不清楚，還需進(jìn)一步的研究。

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