左歸丸逆轉(zhuǎn)Th1／Th2亞群偏移減輕雌激素缺乏骨丟失＊

謝寶華 鞠紅梅 王 麗 周憲賓 郭鈺琪 李 霞△

（1濟(jì)南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南250062；2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，山東 濟(jì)寧272067；3山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南250011）

正常骨代謝是成骨細(xì)胞（OB）與破骨細(xì)胞（OC）參與的骨形成和骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程，此過(guò)程受內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)；內(nèi)分泌—免疫—骨代謝網(wǎng)絡(luò)失衡會(huì)導(dǎo)致多種骨代謝性疾病發(fā)生，如成骨不全、骨質(zhì)疏松癥（OP）等，嚴(yán)重危害患者健康。雌激素是人體重要的性激素，研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)病率隨著年齡的增長(zhǎng)而增高，并與雌二醇水平呈負(fù)相關(guān)［1］。T細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)中重要的細(xì)胞群體，Th1、Th2是經(jīng)典的T細(xì)胞亞群，生理?xiàng)l件下，機(jī)體的Th1和Th2細(xì)胞處于平衡狀態(tài)，如果Th1／Th2的極化發(fā)生偏移容易誘發(fā)病理改變［2］。雌激素—T細(xì)胞—骨代謝三者的關(guān)系成為本領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)問(wèn)題。我們前期研究證實(shí)骨密度與雌激素水平及T細(xì)胞亞群相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)存在顯著相關(guān)性［3］。補(bǔ)腎經(jīng)典方劑左歸丸治療骨代謝疾病效果顯著，研究發(fā)現(xiàn)左歸丸可明顯改善Th1／Th2的漂移狀態(tài)，顯著提高Th2細(xì)胞因子IL－10的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)Th1優(yōu)勢(shì)［4］。本研究以逆轉(zhuǎn)Th1／Th2亞群偏移為切入點(diǎn)，探討雌激素缺乏導(dǎo)致的T細(xì)胞亞群偏移與骨代謝的相關(guān)性，闡釋左歸丸逆轉(zhuǎn)Th1／Th2亞群偏移狀態(tài)減輕雌激素缺乏骨丟失的作用與機(jī)制，為指導(dǎo)臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2010年1月至2012年11月在山東中醫(yī)藥大學(xué)附院查體的自然絕經(jīng)婦女30例，年齡45～65歲，平均（55.93±5.61）歲，絕經(jīng)時(shí)間最長(zhǎng)18a，最短3a，隨機(jī)分為絕經(jīng)組與中藥組，各15例。選取同期在婦科及骨科門(mén)診查體的健康未絕經(jīng)婦女15例，年齡25～45歲，平均（35.30±6.22）歲，平素月經(jīng)規(guī)律，身體健康，未妊娠，納入未絕經(jīng)組。3組均排除其它影響骨代謝的疾病，未用雌激素替代治療及其它治療。本研究經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)附院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象簽署知情同意書(shū)。

1.2 左歸丸提取制備

采用水提、醇溶法提取左歸丸溶液，左歸丸由熟地黃、山藥、枸杞、山茱萸、鹿角膠、龜板膠、川牛膝、菟絲子按8∶4∶4∶4∶4∶4∶4∶3配伍，煎煮濾取藥液，加入烊化的龜板膠和鹿角膠，水浴濃縮，依次加入65%、75%、85%乙醇，沉淀過(guò)夜，濾取上清，水浴減壓法回收乙醇，獲取左歸丸溶液。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 空腹采集研究對(duì)象靜脈血4ml，其中1.5ml離心后取血清，電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清雌二醇（E2）水平；剩余2.5ml采用EDTA抗凝，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），用于流式、Western blot及RT－PCR檢測(cè)。

1.3.2 主要試劑 E2檢測(cè)試劑盒購(gòu)于德國(guó)羅氏公司；M－MLV購(gòu)于Fermentas公司；RNA抑制劑購(gòu)于上海生工生物有限公司；Ionomycin、PMA購(gòu)于Sigma公司；DEPC、GIT、L－Gln購(gòu)于AMRESCO公司；FBS購(gòu)于杭州四季青生物公司；RPMI Medium 1640購(gòu)于GIBCO公司。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 分離靜脈血制備單個(gè)核細(xì)胞懸液，PBS洗2遍，用1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107／ml，接種于24孔板（1ml／孔），分別加入PMA 30ng／ml、Ionomycin 1μg／ml、Monensin 1.7μg／ml，37℃5%二氧化碳刺激培養(yǎng)4h后，收集培養(yǎng)細(xì)胞，PBA（PBS＋0.1%NaN3＋0.1%BSA）洗兩遍，重懸于PBA緩沖液，按說(shuō)明書(shū)加入CD4－FITC和CD3－Cy5熒光抗體，4℃避光染色30min，PBA清洗3遍，加入100μl固定液，4℃，避光固定30min；穿膜液清洗1次，重懸于100μl穿膜液中，加入新鮮小鼠血清20μl／管，4℃，避光封閉30min；分別加入PE標(biāo)記的TNF－α、IL－4熒光抗體，室溫避光染色1h，用穿膜液和PBA各洗1遍后重懸于PBA中，用于流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)外因子的檢測(cè)。

1.3.4 Western blot法檢測(cè)T細(xì)胞亞群特異性核轉(zhuǎn)錄因子蛋白水平 RIPA裂解液裂解PBMC蛋白，高速離心：12000g離心30min，吸取上清蛋白，混勻，沸水中煮3min，取出，12000g離心1min，取上清；電泳分離轉(zhuǎn)膜；25ml TBS洗膜5min，室溫，搖動(dòng)；置膜于25ml封閉緩沖液中1h，室溫，搖動(dòng)，15ml TBS／T洗3次（5min／T）；加入1∶250稀釋的T－bet、GATA3一抗，室溫孵育1h，緩慢搖動(dòng)；15ml TBS／T洗3次（5min／T）；加入1∶1000辣根過(guò)氧化酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，緩慢搖動(dòng)，15ml TBS／T洗3次（5min／T），15ml TBS洗1次；化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.3.5 RT－PCR檢測(cè)T細(xì)胞亞群特征性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平 RNA提?。翰捎卯惲蚯杷犭乙徊椒ㄌ崛BMC總mRNA，紫外分光光度儀檢測(cè)A260／A280比值，驗(yàn)證RNA濃度和純度。RT反應(yīng)：采用oligo dT為RT反應(yīng)引物，取2.5μg總RNA按RT試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 20μl；PCR反應(yīng)：總反應(yīng)體系為25μl，包含RT產(chǎn)物5μl，10×PCR buffer 2.5μl，25mM MgCl22μl，上下 游 引 物 各0.25μl（25pmol），10mM DNPT 0.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，DEPC水14μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，94℃1min，58～60℃1min，72℃1min，26個(gè)循環(huán)后，70℃延長(zhǎng)10min。1.5%凝膠（EB染色）水平電泳，采用Alpha凝膠成像系統(tǒng)分析圖像：以β－actin為內(nèi)參照，計(jì)算目的基因與同步β－actin灰度值比值作為相對(duì)表達(dá)量。

1.3.6 腰椎骨礦物質(zhì)密度（BMD）測(cè)定 研究對(duì)象平躺在測(cè)量床上，雙能X線骨密度儀測(cè)定研究對(duì)象腰椎2～4（L2～4）前后位BMD。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以±s表示。采用One Way－ANOVA方差分析，兩組間比較采用Turkey法檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)間相關(guān)性用Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 血清E2水平比較

未絕經(jīng)組血清E2平均為（91.11±10.01）pg／ml，絕經(jīng)組平均為（33.73±7.12）pg／ml，中藥組平均為（37.09±6.23）pg／ml。與未絕經(jīng)組比較，絕經(jīng)后婦女血清E2水平明顯降低（t＝18.092，P＜0.05）；與絕經(jīng)組比較，中藥組絕經(jīng)婦女E2表達(dá)無(wú)顯著性差異（t＝1.374，P＞0.05），表明左歸丸對(duì)絕經(jīng)婦女E2表達(dá)無(wú)影響，無(wú)明顯雌激素樣作用。見(jiàn)圖1。

圖1 血清E2水平比較

2.2 腰椎L2～4BMD比較

未絕經(jīng)組L2～4BMD平均為（1.28±0.07）g／cm2，絕經(jīng)組平均為（0.87±0.14）g／cm2，中藥組平均為（1.10±0.16）g／cm2。與未絕經(jīng)組相比，絕經(jīng)后婦女腰椎BMD明顯降低（t＝10.559，P＜0.05）；與絕經(jīng)組比較，中藥組絕經(jīng)婦女腰椎BMD明顯升高（t＝4.304，P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 腰椎2～4骨密度比較

2.3 Th1／Th2亞群比例比較

與未絕經(jīng)組相比，絕經(jīng)組Th1亞群比例明顯升高（t＝5.760，P＜0.05），Th2亞群比例明顯降低（t＝3.605，P＜0.05），T細(xì)胞向Th1亞群偏移。與絕經(jīng)組相比，中藥組絕經(jīng)婦女Th1亞群比例明顯降低（t＝3.128，P＜0.05），Th2亞群比例明顯升高（t＝2.424，P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 Th1／Th2亞群比例比較

2.4 E2、骨密度、Th1／Th2亞群比例相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示E2表達(dá)與骨密度呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；骨密度與Th1亞群比例呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與Th2亞群比例呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；E2表達(dá)與Th1亞群比例呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與Th2亞群比例呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 E2、BMD與Th1／Th2亞群比例的相關(guān)性分析

2.5 Th1／Th2亞群特異性核轉(zhuǎn)錄因子（T－bet、GATA－3）蛋白表達(dá)比較

與未絕經(jīng)組比較，絕經(jīng)組Th1亞群特異性核轉(zhuǎn)錄因子（T－bet）蛋白表達(dá)明顯升高（t＝4.343，P＜0.05），Th2亞群特異性核轉(zhuǎn)錄因子（GATA－3）蛋白表達(dá)明顯降低（t＝4.721，P＜0.05）；與絕經(jīng)組比較，中藥組絕經(jīng)婦女T－bet蛋白表達(dá)明顯降低（t＝3.086，P＜0.05），GATA－3蛋白表達(dá)明顯升高（t＝3.535，P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 T－bet、GATA－3蛋白表達(dá)比較

2.6 Th1／Th2亞群特征性細(xì)胞因子（TNF－α、IL－4）mRNA表達(dá)比較

與未絕經(jīng)婦女比較，絕經(jīng)后婦女Th1亞群特征性細(xì)胞因子（TNF－α）mRNA相對(duì)灰度值明顯升高（t＝4.557，P＜0.05），Th2亞群特征性細(xì)胞因子（IL－4）mRNA相對(duì)灰度值明顯降低（t＝4.669，P＜0.05）；與絕經(jīng)婦女相比，中藥組絕經(jīng)婦女TNF－αmRNA相對(duì)灰度值明顯降低（t＝3.092，P＜0.05），IL－4mRNA相對(duì)灰度值明顯升高（t＝4.257，P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 TNF－α、IL－4mRNA表達(dá)比較

3 討論

初始T細(xì)胞遇抗原刺激后在特異性核轉(zhuǎn)錄因子與分化誘導(dǎo)因子作用下，分化為不同亞群，分泌特征性細(xì)胞因子，介導(dǎo)不同的免疫反應(yīng)，對(duì)骨代謝發(fā)揮正向和負(fù)向調(diào)控作用。RANKL是OC分化的關(guān)鍵調(diào)控因子，其受體是位于OC上的RANK，RANKL與RANK結(jié)合，啟動(dòng)OC的分化、成熟和活化過(guò)程［5］。Th1、Th2是經(jīng)典的T細(xì)胞亞群。Th1類(lèi)細(xì)胞因子TNF－α被稱(chēng)為溶骨性細(xì)胞因子，是一種多功能的炎癥介質(zhì)，可通過(guò)誘導(dǎo)OB表達(dá)RANKL，間接促進(jìn)OC分化、成熟，也可直接促進(jìn)RANKL誘導(dǎo)的OC形成和骨吸收［6］。Th2類(lèi)細(xì)胞因子IL－4能抑制RANKL誘導(dǎo)的生理性骨吸收和病理情況下TNF－α誘導(dǎo)OC生成，體外研究顯示IL－4一定條件下能抑制破骨細(xì)胞前體向OC分化及抑制成熟OC的活性，同時(shí)IL－4還抑制OC的RANK表達(dá)［7］。因此，影響T細(xì)胞極化的因素均可影響T細(xì)胞亞群細(xì)胞因子的表達(dá)，從而影響骨代謝。隨著對(duì)神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫網(wǎng)絡(luò)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)雌激素對(duì)T細(xì)胞亞群極化有重要調(diào)節(jié)作用。雌激素是重要的性激素，E2是女性和男性雌激素主要來(lái)源。衰老、應(yīng)激、過(guò)度體力活動(dòng)、低體重等狀態(tài)均可出現(xiàn)雌激素缺乏，導(dǎo)致OP等骨代謝疾病發(fā)生，說(shuō)明雌激素缺乏對(duì)骨代謝有重要影響。研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞上存在雌激素受體，雌激素水平變化可直接影響T細(xì)胞增殖、活化和極化，雌激素缺乏可誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th1漂移，導(dǎo)致T細(xì)胞亞群失衡［8］。因此推斷雌激素—T細(xì)胞—骨代謝三者間有密切的聯(lián)系。臨床上，雌激素替代及免疫調(diào)節(jié)療法治療骨代謝性疾病有確切療效，但存在誘發(fā)子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、乳腺癌、代謝紊亂、感染等危險(xiǎn)，且不適用于男性骨代謝疾病患者。因次，尋找能夠逆轉(zhuǎn)或改善雌激素缺乏誘導(dǎo)的T細(xì)胞亞群極化、糾正骨代謝失調(diào)，又無(wú)雌激素樣及免疫治療副作用的藥物具有良好的應(yīng)用前景。

中醫(yī)認(rèn)為“腎主骨生髓”?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)“腎”的功能覆蓋了神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)，構(gòu)成了完整的人體調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，腎虛可導(dǎo)致神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫網(wǎng)絡(luò)功能失調(diào)，引起骨代謝疾病發(fā)生［9］。以補(bǔ)腎法為原則治療骨代謝疾病療效確切。研究證實(shí)補(bǔ)腎中藥能促進(jìn)OB增殖，抑制OC形成，上調(diào)骨組織I型膠原和骨礦化相關(guān)蛋白表達(dá)，減少尿鈣排泄，升高大鼠骨密度［10］。補(bǔ)腎經(jīng)典方劑左歸丸治療OP等骨代謝疾病效果顯著，可通過(guò)調(diào)節(jié)OB中RANKL表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)OC的抑制［11］。中藥免疫藥理研究證實(shí)左歸丸能調(diào)節(jié)卵巢早衰雌激素缺乏小鼠CD4＋／CD8＋亞群平衡，改善卵巢早衰小鼠免疫功能［12］。但尚未見(jiàn)對(duì)左歸丸及其它補(bǔ)腎方劑逆轉(zhuǎn)或改善雌激素缺乏誘導(dǎo)的T細(xì)胞亞群極化異常調(diào)節(jié)骨代謝的研究報(bào)道。

本研究顯示，婦女絕經(jīng)后血清E2水平與骨密度均明顯降低、Th1亞群比例升高、Th2亞群比例降低；血清E2表達(dá)與骨密度呈正相關(guān)；骨密度、E2表達(dá)與Th1亞群比例呈負(fù)相關(guān)，與Th2亞群比例呈正相關(guān)。此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)雌激素缺乏狀態(tài)誘導(dǎo)Th1／Th2亞群向Th1偏移，且與骨密度降低關(guān)系密切。同時(shí)絕經(jīng)婦女T－bet蛋白表達(dá)、TNF－α mRNA表達(dá)升高，GATA－3蛋白表達(dá)、IL－4mRNA表達(dá)降低，表明雌激素缺乏狀態(tài)下，促進(jìn)骨吸收細(xì)胞因子表達(dá)升高，導(dǎo)致骨密度下降。絕經(jīng)婦女服用左歸丸后，血清E2水平無(wú)明顯變化，表明左歸丸對(duì)機(jī)體無(wú)明顯雌激素樣作用；骨密度、Th2亞群比例升高，Th1亞群比例降低，T－bet蛋白表達(dá)、TNF－αmRNA表達(dá)降低，GATA－3蛋白表達(dá)、IL－4 mRNA表達(dá)升高，表明左歸丸通過(guò)下調(diào)T－bet蛋白表達(dá)、上調(diào)GATA－3蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th2亞群分化，進(jìn)而抑制TNF－αmRNA與蛋白表達(dá)、促進(jìn)IL－4mRNA與蛋白表達(dá)，抑制骨吸收，升高骨密度。綜合以上研究結(jié)果，雌激素缺乏導(dǎo)致的Th1／Th2亞群向Th1偏移是骨丟失發(fā)生的原因；中藥方劑左歸丸通過(guò)干預(yù)T細(xì)胞亞群特異性核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，逆轉(zhuǎn)雌激素缺乏導(dǎo)致的Th1／Th2亞群偏移，抑制骨吸收細(xì)胞因子產(chǎn)生，促進(jìn)骨形成細(xì)胞因子表達(dá)，從而減少骨丟失，促進(jìn)骨形成。

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