正交試驗優選杜仲炮制工藝

羅躍龍，嚴瑞娟，，張水寒，蔡 萍，肖 娟，萬 丹

(1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙410208；2.湖南省中醫藥研究院中藥新藥研究與開發重點實驗室，湖南 長沙410013）

杜仲為杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥樹皮，有補肝腎、強筋骨、安胎之功效，用于治療肝腎不足、腰膝酸痛、胎動不安等癥[1]。明·陳嘉謨《本草蒙筌》提出“入鹽走腎臟仍仗軟堅”，故臨床上杜仲多以鹽炙品入藥，以增強其補腎健腰、強筋骨之功。傳統的炮制方法為鹽炙，標準以斷絲為宜，程度難以掌控，往往“太過”或“不及”，且勞動強度大，后提出烘法炮制杜仲[2]。但以上兩種方法的具體的操作工藝參數均說法不一，造成杜仲炮制品質量難以保證，而飲片質量是發揮臨床療效的關鍵因素，作者未見有杜仲炮制工藝研究將切制規格橫絲、縱絲、塊結合溫度、時間進行考察的記載，因此本文采用正交試驗法，首次以切制規格（橫絲、縱絲、塊）、溫度、時間為考察因素，探索鹽炙和烘制的最佳工藝，以期為提高和規范杜仲飲片的質量提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器

LC-10ATVP高效液相色譜儀（日本島津，配備SPD-M10AVP光電二極管陣列檢測器，CLASS-VP色譜工作站）；AE240型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱 （上海精密實驗設備有限公司）；美的SK2103電磁爐；格蘭仕G8023YSL-V1型微波爐（佛山市順德區格蘭仕微波爐電器有限公司）；KQ3200型超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

松脂醇二葡萄糖苷對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST-12021001，純度＞98%）；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.3 試藥

杜仲皮于2012年6月采自貴州省遵義市楓香鎮，經湖南省中醫藥研究院中藥研究所謝昭明研究員鑒定為杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的樹皮，發汗備用。

2 方法與結果

2.1 杜仲炮制工藝的設計

2.1.1 鹽炙杜仲 通過預實驗及參考文獻[3-4]，選擇切制規格（A）、鹽炙溫度（B）、鹽炙時間（C）作為炮制工藝的考察和外觀質量因素，以松脂醇二葡萄糖苷含量及醇溶性浸出物量作為評價指標，以綜合評分的方法，采用L9（34）表進行正交試驗。具體炮制方法：取杜仲皮，刮去殘留粗皮，洗凈，分別切制成0.5 cm橫絲、0.5 cm縱絲和2 cm×2 cm的塊，干燥。稱取9份，每份100 g，加食鹽水（每100 kg藥材用10 L 20%食鹽水）浸潤，待鹽水被吸盡后，置于鐵鍋中于電磁爐上進行鹽炙，按表1因素水平安排制備炮制樣品，平行試驗3次。

2.1.2 烘制杜仲 通過預實驗及參考相關文獻[3-4]，選擇切制規格（A）、烘制溫度（B）、烘制時間（C）作為炮制工藝的考察和外觀質量因素，以松脂醇二葡萄糖苷含量及醇溶性浸出物量作為評價指標，以綜合評分的方法，采用L9（34）表進行正交試驗。具體炮制方法：同“2.1.1”方法凈制、切制、加鹽水浸潤后，取9份，每份100 g，分別平鋪于瓷托盤上，放入電熱鼓風干燥箱內，按表2因素水平安排制備炮制樣品，平行試驗3次。

表1 鹽炙杜仲因素水平表

表2 烘制杜仲因素水平表

2.1.3 數據處理 為客觀地反映杜仲炮制工藝中各個因素對成品質量的影響，本試驗以傳統外觀質量、醇溶性浸出物量及與杜仲功能主治相關的功效成分松脂醇二葡萄糖苷含量作為評價指標。傳統外觀質量評分，色澤方面：樣品表面黑褐色為5分；表面焦黑為4分；表面淺棕色為3分，再隨顏色變淺依次逐減。斷絲程度：將樣品沿膠絲生長方向拉長0.1 cm斷絲者為5分；拉長0.2 cm斷絲者為4分；拉長0.3 cm斷絲者為3分；依次逐減。以綜合質量評分法進行評價，因有效成分松脂醇二葡萄糖苷含量占據重要地位，故其加權系數為0.7，醇溶性浸出物量加權系數為0.2，傳統外觀質量加權系數為0.1。綜合質量評分＝70×(松脂醇二葡萄糖苷實際量/松脂醇二葡萄糖苷最高量)＋20×(醇溶性浸出物實際量/醇溶性浸出物最高量)＋10×(傳統外觀質量實際評分/傳統外觀質量最高分)。

2.2 醇溶性浸出物的測定[1]

取炮制杜仲樣品適量，剪成碎片，揉成絮狀，取2 g，精密稱定，置250 mL錐形瓶中，精密加75%乙醇100 mL作溶劑，按《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅩA醇溶性浸出物測定法（熱浸法）測定，以干燥品計算樣品中醇溶性浸出物量。

2.3 松脂醇二葡萄糖苷含量的測定[1]

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Promosil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為甲醇-水(25∶75)，檢測波長277 nm，體積流量1.0 mL/min，柱溫25℃，進樣量20μL。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取松脂醇二葡萄糖苷對照品適量，加甲醇制成濃度為0.49 mg/mL的溶液，搖勻即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 取炮制杜仲樣品適量，剪成碎片，揉成絮狀，取約5 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇50 mL，稱定質量，超聲處理60 min[5]，放冷。再稱定質量，用50%乙醇補足減失的質量，搖勻，0.45μm濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3.4 線性關系考察 精密吸取對照品溶液2、4、8、12、16、20μL注入高效液相色譜儀，測定。對照品進樣量（Y）對其相應色譜峰峰面積（X）的線性回歸方程為：

表明松脂醇二葡萄糖苷在0.98～9.8μg范圍內峰面積與進樣量的線性關系良好。

2.3.4 樣品測定 分別精密吸取各炮制杜仲樣品的供試品溶液20μL、對照品溶液20μL，分別注入高效液相色譜儀中，按照“2.3.1”項下色譜條件進行測定，外標一點法計算樣品（以干燥品計）中松脂醇二葡萄糖苷的含量。

2.4 試驗結果及方差分析

2.4.1 試驗結果 鹽炙和烘制杜仲工藝的正交試驗結果見表3～4。

表3 鹽炙杜仲工藝正交試驗結果 （±s，n=3）

表3 鹽炙杜仲工藝正交試驗結果 （±s，n=3）

列號 A B C 空白 松脂醇二葡萄糖苷(m g/g) 醇浸出量(%) 外觀質量(分) 綜合評分1 1 1 1 1 0.59±0.0 1 14.84±0.41 6 33.79 2 1 2 2 2 0.59±0.0 1 14.81±0.34 9 36.75 3 1 3 3 3 0.88±0.0 1 16.44±0.38 8 42.81 4 2 1 2 3 1.11±0.02 16.35±0.35 5 43.79 5 2 2 3 1 1.94±0.0 4 17.15±0.37 6 60.47 6 2 3 1 2 1.85±0.0 3 15.98±0.42 9 60.50 7 3 1 3 2 2.71±0.0 4 16.85±0.52 7 74.80 8 3 2 1 3 2.43±0.0 4 16.33±0.42 9 71.22 9 3 3 2 1 1.76±0.0 4 15.90±0.52 8 57.81 K 1 113.35 152.37 165.51 152.07 K 2 164.76 168.44 138.35 172.05 K 3 203.82 161.12 178.07 157.81 R 90.47 16.07 39.72 19.98

表4 烘制杜仲工藝正交試驗結果 （±s，n=3）

表4 烘制杜仲工藝正交試驗結果 （±s，n=3）

列號 A B C 空白 松脂醇二葡萄糖苷(m g/g) 醇浸出量(%) 外觀質量分(分) 綜合評分1 1 1 1 1 1.19±0.0 2 15.21±0.38 9 47.88 2 1 2 2 2 0.75±0.0 1 14.22±0.30 9 38.91 3 1 3 3 3 0.52±0.0 1 12.72±0.35 9 33.07 4 2 1 2 3 1.79±0.0 3 16.67±0.46 10 61.24 5 2 2 3 1 1.51±0.0 3 15.53±0.42 7 51.94 6 2 3 1 2 1.21±0.0 2 11.18±0.26 9 43.54 7 3 1 3 2 3.94±0.0 8 16.33±0.47 9 98.04 8 3 2 1 3 0.44±0.0 1 12.17±0.25 8 30.01 9 3 3 2 1 0.07±0.0 1 12.76±0.32 8 24.12 K 1 119.86 207.17 121.42 123.94 K 2 156.72 120.86 124.27 180.49 K 3 152.18 100.73 183.05 124.32 R 36.86 106.44 61.63 56.55

2.4.2 方差分析 鹽炙杜仲及烘制杜仲的方差分析結果分別見表5～6。

表5 鹽炙杜仲工藝方差分析表

表6 烘制杜仲工藝方差分析表

鹽炙杜仲工藝以綜合質量為評價指標時，由極差R可知影響鹽炙杜仲質量的主次因素依次為A＞C＞B，方差分析結果顯示，A因素有顯著性影響，而B和C因素無明顯影響；最佳鹽炙工藝方案為A3B2C3，即切制成2 cm×2 cm的塊，鹽炙溫度為180℃，鹽炙時間為10 min。

烘制杜仲工藝以綜合質量為評價指標時，由極差R可知影響烘制杜仲質量的主次因素依次為B＞C＞A，方差分析結果顯示，方差分析結果顯示，A、B和C因素均無明顯影響；最佳烘制工藝方案為A2B1C3，即切制成0.5 cm的縱絲，烘制溫度為120℃，烘制時間為0.5 h。

2.5 驗證試驗

本實驗優選出的鹽炙與烘制工藝最佳組合均不在正交表試驗方案中，故需進行驗證試驗。鹽炙：將杜仲切制成2 cm×2 cm的塊，稱取100 g置于鐵鍋中，于電磁爐上180℃鹽炙10 min，取出，晾涼即得。平行試驗3次。烘制：將杜仲切制成0.5 cm的縱絲，稱取100 g平鋪于瓷托盤上，放入120℃的電熱鼓風干燥箱內，烘制0.5 h。平行試驗3次。驗證結果見表7。并用SPSS 16.0軟件對兩種工藝結果進行t檢驗。

表7 驗證試驗結果 （±s）

表7 驗證試驗結果 （±s）

試驗組 松脂醇二葡萄糖苷(mg/g) 醇浸出量(%)鹽炙 2.78±0.04 17.13±0.05烘制 4.01±0.04 16.48±0.05

驗證試驗表明，二指標數據均大于正交表9個組合中任何一組，故優選的工藝參數合理可行，能制備出質量穩定的杜仲飲片。用SPSS 16.0軟件輸出的t檢驗結果中，t統計量的相伴概率P均為0，小于顯著性水平0.05，證明兩種工藝的松脂醇二葡萄糖苷含量和醇浸出量平均值存在顯著性差異?？紤]到松脂醇二葡萄糖苷為杜仲的主要有效成分，故認為烘制工藝為較佳選擇。

3 討論

前人對杜仲炮制品質量評價方面，有的采用斷絲率或單采用醇浸出物為指標，評價指標單一。松脂醇二葡萄苷為杜仲的主要的降壓成分[6]，以其為主要評價指標，再結合《中華人民共和國藥典》2010版一部中規定的醇浸出物量，更能合理地反映出炮制品的質量。另外，在炮制工藝的考察因素上，前人還常涉及加鹽量的考察，但通過預實驗及文獻研究，加鹽量對炮制質量影響不大，反而是不同的切制規格成為炮制質量優劣的關鍵因素，故本文將切制規格列為考察對象之一。

本研究同時優選了鹽炙和烘制兩種方法的操作工藝，其中烘制工藝中于120℃烘制0.5 h時縱絲和塊的綜合評分均較高，鹽炙最佳工藝的切制規格亦為塊，這與歷來研究得出的杜仲以切制成橫絲為最佳的結論有所不同，可見切制規格或許也因“法”制宜。通過比較兩種炮制方法的最佳工藝，烘制品較鹽炙品綜合質量高，且烘法有節能、回收率高、勞動強度低等優點，便于規?；?。后續研究將進一步從藥理學試驗、臨床研究等方面論證烘制杜仲的工藝效果，企業可考慮以此法替代傳統鹽炙法而達到低成本規范化生產，并提高杜仲飲片的質量從而提高效益。

[1]中國藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：154.

[2]郝武常，朱志峰，朱宇紅，等.炮制對杜仲中松脂醇二葡萄糖苷含量的影響[J].中國中藥雜志，1996，21(7)：410.

[3]李 川.不同炮制方法對杜仲總成分煎出率的影響[J].中藥材，1989，12(2)：29.

[4]高學昌，趙海東.杜仲炮制初探[J].時珍國醫國藥，1994，5(3)：25.

[5]馮鎖民，甘志杰，翟西峰，等.杜仲原生皮與再生皮中松脂醇二葡萄糖苷的含量比較[J].中藥材，2006，28(8)：792-794.

[6]韓宇東，李文娜.杜仲的化學成分和藥理活性及臨床應用研究新進展[J].中國實用醫學雜志，2010，20(5)：3-5.