外周血單核細(xì)胞TLR2、TLR4與急性胰腺炎肺損傷的關(guān)系

蔣海弦，李天舒，顧國寶，周鳴清，陸仁達(dá)

（上海閘北區(qū)中心醫(yī)院，上海200070）

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是胰酶引起的一種化學(xué)炎癥反應(yīng)性疾病，其出血壞死型（acute necrotizing pancreatitis，ANP）病情兇險(xiǎn)，預(yù)后差，病死率高達(dá)50%左右。急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷（acute pancreatitis－associated lung injury，APALI）是AP最常見的并發(fā)癥，是患者早期死亡的重要原因.炎癥介質(zhì)的互相激活和級聯(lián)反應(yīng)是APALI的重要發(fā)生機(jī)制之一。多種炎性因子參與了急性胰腺炎肺損傷的發(fā)生，如IL－6，TNF－α，p物質(zhì)等，其中涉及多種細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞等［1］。最近研究發(fā)現(xiàn)［2］，toll樣受體（toll－like receptor，TLR）參與了急性胰腺炎并發(fā)肺損傷的過程，敲除TLR4基因的小鼠，急性胰腺炎炎癥程度減輕且肺損傷明顯減少。但TLR是否與急性胰腺炎肺損傷的發(fā)生相關(guān)，仍缺乏臨床資料。本研究擬回顧分析本院收治的急性胰腺炎患者外周血單核細(xì)胞TLR2、4的表達(dá)與急性胰腺炎合并肺損傷的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取2010年01月－2011年06月我科收治的急性胰腺炎患者30例，其中男性16例，女性14例；年齡21－62歲（平均45.9±12.2歲）；并選擇10例體檢健康人群作為對照，其中男女性各5例，年齡35－64歲（平均51.1±12.6歲）。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)

急性胰腺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合急性胰腺炎的臨床征象（腹痛、腹脹、惡心嘔吐、腹部壓痛等）；入院時(shí)血淀粉酶大于正常上限3倍或以上；有或無影像學(xué)診斷（B超或C T）者，無論病情輕重均納入（參照1992年亞特蘭大會(huì)議標(biāo)準(zhǔn)［3］或1996年中華醫(yī)學(xué)會(huì)外科學(xué)會(huì)胰腺學(xué)組標(biāo)準(zhǔn)［4］。

1.3外周血單核細(xì)胞TLR mRNA表達(dá)檢測

空腹肘靜脈全血5ml，參考文獻(xiàn)報(bào)道方法［5］，采用Ficoll－Hypaque密度分離法分離外周血單核細(xì)胞，Trizol抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA（Promega公司），等量cDNA依照PCR Kit（Invitrogen公司）提供的步驟進(jìn)行PCR。參考文獻(xiàn)，其引物序列如下：TLR2（6）上游引物CCCAGGAAAGCTCCCAGCAG，下 游 引 物 GGAACCTAGGACTTTATCGCAGCTC；TLR4（7）上游引物CATTCAAGACCAAGCCTTTCAG，下 游 引 物 CCAGGTTTTGAAGGCAAGTTTT；GAPDH（7）上游引物 TGCACCACCAACTGCTTAG，下 游 引 物GGATGC AGGGATGATGTTC。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性7min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共33個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物加樣于2%瓊脂糖凝膠，電泳，紫外燈下觀察，凝膠分析系統(tǒng)拍照。Quantity one軟件分析，目的基因／GAPDH值為相對表達(dá)量。按TLR2與TLR4mRNA相對表達(dá)量，將急性胰腺炎患者分為TLR2、4高表達(dá)組（≥2倍健康組）與低表達(dá)組（＜2倍健康組）。

1.4統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，其中不同組別間計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)；不同分組中急性胰腺炎肺損傷的比較，采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

與健康組相比較，急性胰腺炎患者外周單核細(xì)胞TLR2與TLR4mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.01）。（圖1）

圖1 急性胰腺炎TLR2與TLR4蛋白表達(dá)

按TLR2mRNA表達(dá)水平將急性胰腺炎患者分為兩組：TLR2高表達(dá)組（≥2倍健康組）與TLR2低表達(dá)組（＜2倍健康組），TLR2的表達(dá)與急性胰腺炎并發(fā)肺損傷無明顯相關(guān)（P＝0.105），不同TLR2mRNA表達(dá)組的急性胰腺炎患者發(fā)生肺損傷的OR值3.677倍，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（95%CI：0.733－18.332）（表1）。

表1 不同外周單核細(xì)胞TLR2表達(dá)急性胰腺炎肺損傷比較

按TLR4mRNA表達(dá)水平將急性胰腺炎患者分為兩組：TLR4高表達(dá)組（≥2倍健康組）與TLR4低表達(dá)組（＜2倍健康組），TLR4的表達(dá)與急性胰腺炎并發(fā)肺損傷明顯相關(guān)（P＜0.01），不同TLR4mRNA表達(dá)組的急性胰腺炎患者發(fā)生肺損傷的 OR 值為 18，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （95%CI：2.756－117.544）。

表2 不同外周單核細(xì)胞TLR4表達(dá)急性胰腺炎肺損傷比較

3 討論

急性胰腺炎（AP）的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、病程兇險(xiǎn)，病死率極高，在其胰外損傷中以急性肺損傷（ALI）最為突出，甚至可繼發(fā)急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。如何能早期發(fā)現(xiàn)或預(yù)測急性胰腺炎并發(fā)肺損傷的患者，爭取早期的干預(yù)，對于減少急性胰腺炎病死率有著重要的臨床意義。

研究發(fā)現(xiàn)，AP中常伴發(fā)腸源性內(nèi)毒素血癥，脂多糖（LPS）濃度常常增高［8］。TLR家族是LPS的受體，主要分布在單核／巨噬細(xì)胞表面的TLR4、TLR2對LPS炎癥信號向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起主要作用［9］。TLR2、TLR4與LPS結(jié)合后，通過激活單核細(xì)胞內(nèi)的NF－κb信號通路，促進(jìn)炎性因子如IL－1、TNF等的分泌，從而在急性胰腺炎發(fā)生中起著重要的作用［10］。本研究中，我們檢測急性胰腺炎的單核細(xì)胞TLR2與TLR4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TLR2及TLR4mRNA表達(dá)水平明顯增高，這與前期的研究結(jié)果一致。

多項(xiàng)研究表明，AP肺損傷與肺組織內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤，包括中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞，單核／巨噬細(xì)胞在AP并發(fā)肺損傷的發(fā)生中起著重要作用［11］。AP發(fā)生時(shí)，肺部的炎癥反應(yīng)會(huì)促使LPS的大量增多，通過TLR受體激活肺部聚集的單核／巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮功能的損傷，并抑制Fas基因的表達(dá)，減少炎性細(xì)胞的凋亡［12，13］，這提示 LPSTLR軸在單核細(xì)胞的激活可能是肺損傷發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制。本研究中，我們通過檢測AP并發(fā)肺損傷患者單核細(xì)胞的LPS主要受體TLR2與TLR4表達(dá)，并將其分為（≥2倍健康組）與TLR2低表達(dá)組（＜2倍健康組），發(fā)現(xiàn)TLR2的表達(dá)與AP肺損傷發(fā)生之間無明顯相關(guān)；而TLR4的表達(dá)與AP并發(fā)肺損傷明顯相關(guān)，高表達(dá)TLR4的患者AP并發(fā)肺損傷風(fēng)險(xiǎn)是低表達(dá)的18倍，這提示AP單核細(xì)胞TLR4的表達(dá)高低是AP并發(fā)肺損傷的危險(xiǎn)因素。前期研究發(fā)現(xiàn)，盡管TLR2與TLR4均是LPS的受體，但TLR4主要介導(dǎo)革蘭氏陰性菌引起的炎性反應(yīng)，是LPS在單核細(xì)胞效應(yīng)的主要介導(dǎo)者［9，14］，這可能是TLR4而不是TLR2的在單核細(xì)胞的表達(dá)是AP并發(fā)肺損傷的危險(xiǎn)因素。

值得注意的是，本研究雖然提示TLR4的單核細(xì)胞的表達(dá)是AP并發(fā)肺損傷的危險(xiǎn)因素，但由于本研究樣本量偏小，這可能會(huì)造成研究結(jié)果的偏倚；另外，由于研究條件的限制，本研究中沒有排除患者基礎(chǔ)的炎癥及免疫狀態(tài)對單核細(xì)胞TLR4預(yù)先激活的影響，這些均需要后續(xù)深入研究。盡管如此，本研究通過病例對照發(fā)現(xiàn)TLR4在單核細(xì)胞的表達(dá)是AP并發(fā)肺損傷的一個(gè)危險(xiǎn)因素，為AP并發(fā)肺損傷的高危人群篩選提供了一個(gè)潛在的指標(biāo)。

［1］許 威 夏，陳 虹.炎癥介質(zhì)與急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷［J］.世界華人消化雜志，2006，14（12）：1188.

［2］Sharif R，Dawra R，Wasiluk K，Phillips P，Dudeja V，Kurt－Jones E，F(xiàn)inberg R，Saluja A.Impact of toll－like receptor 4on the severity of acute pancreatitis and pancreatitis－associated lung injury in mice［J］.Gut，2009，58（6）：813.

［3］Bradley EL，3rd.A clinically based classification system for acute pancreatitis.Summary of the international symposium on acute pancreatitis［J］.Arch Surg，1993，128（5）：586.

［4］中華醫(yī)學(xué)會(huì)外科學(xué)會(huì)胰腺學(xué)組.急性胰腺炎的臨床診斷及分級標(biāo)準(zhǔn)［J］.中華外科雜志，1997，35（12）：773.

［5］劉文佳，周 洪，王曉榮.體外誘導(dǎo)臍血單核細(xì)胞分化為破骨樣細(xì)胞的研究［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2007，28（5）：551.

［6］Lew BL，Sim WY，Kim NI.Expression of toll－like receptor 2in cultured human keratinocytes：The effect of bacterial antigens，cytokines and calcium concentration［J］.Ann Dermatol，2009，21（4）：337.

［7］Lim BJ，Lee D，Hong SW，et al.Toll－like receptor 4signaling is involved in iga－stimulated mesangial cell activation［J］.Yonsei Med J，2011，52（4）：610.

［8］Pascual JL，Khwaja KA，F(xiàn)erri LE，et al.Hypertonic saline resuscitation attenuates neutrophil lung sequestration and transmigration by diminishing leukocyte－endothelial interactions in a two－h(huán)it model of hemorrhagic shock and infection［J］.J Trauma，2003，54（1）：121.

［9］Vabulas RM，Ahmad－Nejad P，Costa C，et al.Endocytosed hsp60s use toll－like receptor 2 （tlr2）and tlr4to activate the toll／interleukin－1receptor signaling pathway in innate immune cells［J］.J Biol Chem，2001，276（33）：31332.

［10］Pandey S，Agrawal DK.Immunobiology of toll－like receptors：E－merging trends［J］.Immunol Cell Biol，2006，84（4）：333.

［11］Misharin AV，Scott Budinger GR，Perlman H.The lung macrophage：A jack of all trades［J］.Am J Respir Crit Care Med，2011，184（5）：497.

［12］Chooklin S.Pathogenic aspects of pulmonary complications in acute pancreatitis patients［J］.Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2009，8（2）：186.

［13］Yubero S，Ramudo L，Manso MA，De Dios I.Targeting peripheral immune response reduces the severity of necrotizing acute pancreatitis［J］.Crit Care Med，2009，37（1）：240.

［14］Re F，Strominger JL.Toll－like receptor 2（tlr2）and tlr4differentially activate human dendritic cells［J］.J Biol Chem，2001，276（40）：37692.