檢測化療藥聯(lián)合TRAIL后對胃腸道腫瘤細胞的影響

張光孜劉文志* 高海德柳仲林李興中

（1 大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院普外5科，遼寧 大連 116001；2 大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院，遼寧 大連 116001；3 大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院普外科，遼寧 大連 116001）

檢測化療藥聯(lián)合TRAIL后對胃腸道腫瘤細胞的影響

張光孜1劉文志2* 高海德3柳仲林3李興中3

（1 大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院普外5科，遼寧 大連 116001；2 大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院，遼寧 大連 116001；3 大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院普外科，遼寧 大連 116001）

目的 探討化療藥聯(lián)合 TRAIL 后對胃腸道腫瘤細胞存活和凋亡的影響。方法 單純用化療藥抑制腸癌細胞為對照組，化療藥聯(lián)合TRAIL 抑制腸癌細胞為實驗組，兩組均用 MTT 法測定存活率和 Annexin V/PI 染色流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。結(jié)果 實驗組的腸癌細胞存活率低于對照組，而凋亡率明顯高于實驗組，差異 P ＜ 0.05 具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 化療藥聯(lián)合 TRAIL 能有效降低抑制胃腸道腫瘤細胞的生長，促進凋亡，降低存活率，提高凋亡率。

化療藥；TRAIL；胃腸道腫瘤細胞

近年來，腫瘤患病率逐年升高，其產(chǎn)生的癥狀對患者的身體質(zhì)量水平產(chǎn)生嚴(yán)重影響。提高化療藥物的靶向性，降低其臨床產(chǎn)生的毒性，已經(jīng)成為現(xiàn)代抗腫瘤藥物的研究熱點[1]。TRAIL是在研究腫瘤性質(zhì)細胞、病毒感染性細胞以及轉(zhuǎn)化性細胞中發(fā)現(xiàn)的一種可以促進以上細胞不斷病變壞死，而對人體內(nèi)正常細胞卻無產(chǎn)生較明顯毒性消極作用。本文檢測化療藥聯(lián)合TRAIL后對胃腸道腫瘤細胞的影響，取得滿意的結(jié)果，現(xiàn)將具體過程報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

腸癌細胞組織由我院腫瘤免疫實驗室提供；化療藥替吉奧由齊魯制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字為H20100151；腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）5μg/mL由上海彩佑生物化工有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 腸癌細胞株培養(yǎng)方法

將腸癌細胞株置入含有新生牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，其中，新生牛血清的濃度為10%，培養(yǎng)液溫度控制在37℃左右進行恒溫條件下培養(yǎng)，CO2濃度含量控制在5%，培養(yǎng)箱中濕度需充分飽和。選取處在對數(shù)生長期的腸癌細胞置入經(jīng)一定濃度稀釋后的培養(yǎng)液并在培養(yǎng)板中接種，培養(yǎng)板共96孔，一孔200μL，平均每孔含癌細胞量為5×103個，注意培養(yǎng)液環(huán)境條件與細胞株保持一致，并將培養(yǎng)板分為為空白組、對照組和實驗組三份。其中對空白組加入RPMI1640培養(yǎng)液進一步培養(yǎng)，對照組加入化療藥替吉奧，實驗組加入化療藥聯(lián)合TRAIL，三組皆繼續(xù)培養(yǎng)20h。

1.2.2 MTT細胞毒性實驗

三組培養(yǎng)液皆加入MTT含量為20μL后繼續(xù)培養(yǎng)4h，培養(yǎng)液上清部分吸去后，加入DMSO用量200μL，震蕩5min，將培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀上，在電子顯微鏡下統(tǒng)計活的癌細胞數(shù)量，計算存活率，對照組癌細胞存活率=（活的癌細胞數(shù)量 / 總的癌細胞數(shù)量）×100%。重復(fù)三次，取均數(shù)。

1.2.3 Annexin V/PI染色流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

取空白組、對照組和實驗組對數(shù)期細胞培養(yǎng)板，收集懸浮細胞：0.25%胰酶及0.02%EDTA（1∶1）收集消化貼壁細胞與懸浮細胞，離心，吸去上清培養(yǎng)液，預(yù)冷洗滌細胞。重新懸浮細胞，濃度控制在2 ×106/mL左右。然后取300μL細胞懸液于5mL流式管中，加入5μL Annexin V/FITC和10μLPI溶液混勻。室溫在避光孵育15min后，用流式細胞儀檢測凋亡率，重復(fù)三次，取均數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文研究所得的數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析，組間差異采用t檢驗，差異P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

相對僅采取單純化療藥治療的對照組，實驗組的腸癌細胞存活率低于對照組，而凋亡率明顯高于實驗組，產(chǎn)生差異明顯，具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 對照組和實驗組抑制率和凋亡率

3 討 論

腫瘤疾病是由于人體體內(nèi)在致癌因子發(fā)生作用使癌細胞突然性大量復(fù)制增生，基因的細胞生長調(diào)控力功能消失導(dǎo)致病變細胞累積的一種頑癥，若形成惡性的腫瘤將成為癌癥[2]。目前臨床上治療腫瘤的有效方法是直接切除病灶組織和化療，大部分患者為減少開刀痛苦一般傾向化療治療。但化療藥物存在嚴(yán)重的毒副作用以及其耐藥性高，給臨床資料帶來了很大的困難，研究其提高其靶向性和降低耐藥性是抗腫瘤方向的研究熱門。

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（Tumor Necrosis Factor Related Apoptosis Inducing Ligand，TRAIL）屬于II 型跨膜蛋白質(zhì)，是Wiley等從人心肌cDNA文庫中克隆出來的。TRAIL有4種受體，死亡受體DR4、DR5， 誘捕受體DCR1、DCR2。TRAIL通過與死亡受體結(jié)合啟動細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活半胱-天冬氨酸蛋白酶（ cys-teine containing asparate specific protease，Caspase）級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)細胞凋亡，其中Caspase 8為啟始Caspase。它的氨基酸含有腫瘤病變因子的結(jié)構(gòu)特征，具有誘導(dǎo)Jurkat 細胞以及EB 病毒轉(zhuǎn)化形成異樣的人體淋巴細胞并促進其凋亡的能力。此外，TRAIL 還具備有通過誘導(dǎo)正常細胞轉(zhuǎn)化成腫瘤類別細胞或病毒類別細胞并且能不斷促進新生細胞凋亡，且可以發(fā)生的部位即可以在人體外也可以在人體內(nèi)，速度快，數(shù)量巨大。在目前階段已經(jīng)有許多國外學(xué)者出現(xiàn)使用TRAIL聯(lián)合順鉑或依托泊試對膠質(zhì)瘤細胞進行處理的研究，結(jié)果表現(xiàn)出TRAIL聯(lián)合順鉑或依托泊試可以增強其誘導(dǎo)凋亡能力[3]。國內(nèi)也有學(xué)者報道了TRAIL 聯(lián)合氟尿嗜嚨處理結(jié)腸癌細胞聯(lián)合阿霉素或者絲裂霉素處理肝癌細胞實驗的研究[4]。

本文研究中，對照組采用單純化療藥替吉奧抑制腸癌細胞，實驗組采用化療藥替吉奧聯(lián)合TRAIL抑制腸癌細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組的腸癌細胞存活率明顯低于對照組的存活率，但在凋亡率方面明顯高出實驗組細胞，且產(chǎn)生的差異明顯均具有統(tǒng)計學(xué)意義。此結(jié)果說明聯(lián)合應(yīng)用TRAIL與化療藥對抑制及誘導(dǎo)胃腸道腫瘤細胞凋亡具有顯著的協(xié)同作用。

綜上所述，化療藥聯(lián)合TRAIL能有效降低抑制胃腸道腫瘤細胞的生長，促進凋亡，降低胃腸道腫瘤細胞的存活率，提高凋亡率。

[1]王宏艷,常瑛.重組可溶性TRAIL聯(lián)合化療藥誘導(dǎo)急性白血病細胞凋亡[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2008,29(3):364-365.

[2]佟海俠,馬力,金紅麗,等. TRAIL聯(lián)合化療藥物誘導(dǎo)神經(jīng)母細胞瘤細胞凋亡的研究[J]. 中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2006,25(4):348-349.

[3]Alaimo A,Gorojod RM,Kotler ML.The extrinsic and intrinsic apoptotic pathways are involved in manganese toxicity in rat astrocytoma C6 cells[J].neurochem Int,2011,59(2):297-308.

[4]佟海俠,張繼紅,陸春偉,等.IFNr、TRAIL及化療藥聯(lián)合誘導(dǎo)神經(jīng)母細胞瘤細胞凋亡的研究[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2007,15(2):157-159.

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：1671-8194（2013）08-0163-02

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