健康志愿者氯沙坦鉀片的生物等效性研究

金 杰*

（阿特維斯（佛山）制藥有限公司，廣東 佛山 528000）

健康志愿者氯沙坦鉀片的生物等效性研究

金 杰*

（阿特維斯（佛山）制藥有限公司，廣東 佛山 528000）

目的 建立人血漿中氯沙坦及其代謝物氯沙坦羧酸（EXP3174）濃度的測定方法，并評價 2 種氯沙坦鉀片在健康志愿者體內(nèi)的生物等效性。方法 23 例男性健康志愿者隨機雙周期交叉給藥，口服受試制劑和參比制劑 50mg，清洗期 1 周，HPLC-MS/MS 法測定血漿中氯沙坦和 HPLC-熒光法測定血漿中氯沙坦代謝物 EXP3174 濃度。所得數(shù)據(jù)經(jīng) WinNonlin 6.0 軟件分析，計算氯沙坦及 EXP3174 在人體內(nèi)的藥代動力學參數(shù)。結(jié)果 口服受試制劑和參比制劑后，志愿者的氯沙坦和 EXP3174 主要藥代動力學參數(shù)如下：氯沙坦 Cmax分別為（244.8561±86.9741）ng/mL，（266.8621± 115.5986）ng/mL；AUC0-t分別為（451.4±151.8）ng/（h ·mL），（459.4±163.7）ng/（h ·mL）；AUC0-∞分別為（469.8±155.1）ng/（h ·mL），（477.9 ±166.2）ng/（h ·mL）；t1/2分別為（1.55±0.32）h，（1.65±0.37）h；Tmax 分別為：（1.09±0.62）h，（1.25±0.75）h。EXP3174 Cmax分別為（399.4 ±100.5）ng/mL，（426.8±132.6）ng/mL；AUC0-t分 別 為（3231±1064）ng/（h ·mL），（3152±1058）ng/（h ·mL）；AUC0-∞分 別 為（3458± 1152）ng/（h ·mL），（3408±1061）ng/（h ·mL）；t1/2分別為（6.86±2.25）h，（5.77±1.47）h；Tmax分別為：（3.48±0.89）h，（3.13±0.69）h。結(jié)論氯沙坦鉀受試制劑與參比制劑在人體內(nèi)具有生物等效性。

氯沙坦；EXP3174；高效液相色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜；高效液相色譜 -熒光檢測；生物等效性

氯沙坦鉀是全球第一個上市的口服非肽類血管緊張素Ⅱ受體拮抗藥，可以阻斷內(nèi)源性及外源性的血管緊張素所產(chǎn)生的各種藥理作用，具有良好的抗高血壓療效。氯沙坦鉀口服吸收良好，經(jīng)首過代謝后形成羧酸型活性代謝物EXP3174及其他無活性代謝物[1]。主要活性代謝物EXP3174的降壓作用為氯沙坦的10倍[2]。因此在研究氯沙坦生物等效性和藥代動力學時，同時測定氯沙坦和EXP3174是十分必要的。體內(nèi)外研究表明：氯沙坦及EXP3174可以阻斷任何來源或任何途徑合成的血管緊張素Ⅱ所產(chǎn)生的相應的生理作用，與其他肽類的血管緊張素Ⅱ拮抗劑相比，氯沙坦鉀無激動作用。本文用HPLC-MS/MS法測定人體內(nèi)氯沙坦的血漿濃度及用HPLC-FLU法測定EXP3174的血漿濃度，對2種氯沙坦鉀片進行生物等效性評價，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

氯沙坦鉀片（規(guī)格：50mg/片，批號：124864），阿特維斯（佛山）制藥有限公司提供；氯沙坦鉀片（商品名：科素亞?，規(guī)格：50mg/片，批號：100520），杭州默沙東制藥有限公司生產(chǎn)；氯沙坦鉀對照品（批號：100597-200501，含量：100%），中國藥品生物制品檢定所；纈沙坦對照品（批號：100651-200902，含量：98.9%），中國藥品生物制品檢定所；氯沙坦羧酸（EXP3174）對照品（批號：6023，含量：95%），Ramidus AB公司；坎地沙坦對照品（批號：4-ARP-147-1，含量：98%），Toronto Research Chemicals Inc.；甲酸、乙腈、甲醇、甲基叔丁基醚和三乙胺為色譜純；磷酸二氫鉀和磷酸為分析純；純凈水為杭州娃哈哈集團有限公司生產(chǎn)；空白血漿由中國人民解放軍第二〇八醫(yī)院提供。

1.2 儀器

API-2000串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源，Analyst? 1.5.1質(zhì)譜工作站，美國AB SCIEX公司）；Ultimate 3000型高效液相色譜儀（含DCMS Link 2.7.0 for Analyst液相工作站、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱，美國戴安公司）；LC-10ATvp型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Agilent 1200 G1321A熒光檢測器（含Agilent ChemStation for LC工作站，美國安捷倫公司）；XW-80A微型旋渦混合儀（上海滬西儀器廠有限公司）；KS康氏振蕩器（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；TGL-16M/TGL-20M高速臺式冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；TGL-16G臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；AUW120D分析天平（日本島津公司）；JA2003N電子天平、PHS-3E型PH計（上海精密科學儀器有限公司）；MTN-2800W型氮吹濃縮儀（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 試驗設計

所有志愿者在試驗前簽署知情同意書，臨床試驗方案經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院倫理委員會批準，試驗在遼寧中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院藥物臨床試驗機構進行。試驗前對志愿者進行一般的體格檢查，包括生命體征、血尿常規(guī)、血生化（肝腎功能、K+、Na+等）及12導聯(lián)心電圖檢查等。體檢合格的24例健康男性志愿者入組參加試驗，其中1例由于個人原因于第一周期服藥前退出試驗，故最終23例志愿者完成了本試驗。

本試驗采用開放隨機的雙周期雙交叉試驗設計。每個周期志愿者禁食過夜至少10h后，次日晨空腹以250mL溫開水送服50mg受試制劑或參比制劑，服藥后要檢查志愿者口腔和盛藥容器，以確保藥物的正確服用，同時進行必要的安全性評價。經(jīng)過一周的清洗期后交叉服藥。于每周期服藥前及服藥后0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00、6.00、8.00、12.00、24.00、36.00、48.00h采集靜脈血5mL。采集后的血樣以肝素抗凝，離心分離血漿后于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

每周期服藥后2h方可按需飲水，服藥后4h、10h統(tǒng)一進標準餐，志愿者至少從服藥前10d到最后一次采血前，禁服葡萄柚及其任何加工品；至少從服藥前7d到最后一次采血前，禁服任何維生素補充劑和天然產(chǎn)品（包括草藥，大蒜補充劑和圣約翰草）；在試驗期間至少從服藥前24h到最后一次采血前，禁服任何含黃嘌呤的食品和飲料，并禁止吸煙；至少從服藥前48h到最后一次采血前，禁服任何含酒精的食品和飲料。

1.3.2 血漿樣品中氯沙坦?jié)舛鹊臏y定

1.3.2.1 色譜-質(zhì)譜條件

分析柱：Platisil ODS（150mm×4.6mm，5μm）；預柱：琛航C18保護柱；流動相：0.2%甲酸-乙腈（30∶70）；流速：梯度流速；柱溫：30℃；自動進樣器溫度：10℃；進樣量：5μL。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源（ESI源）；氣簾氣：10 Psi；碰撞氣：4 Psi；Gas1：70 Psi；Gas2：50 Psi；霧化溫度：450 ℃；噴霧電壓：4500 V；正離子方式檢測；掃描方式為多反應離子監(jiān)測（MRM），用于定量分析的離子分別為氯沙坦（m/z）422.9→206.9和纈沙坦（m/z）436.1→291.2。

1.3.2.2 血漿樣品處理

精密量取血漿樣品200μL，置10mL離心管中，加入甲醇-水（1∶1）溶液20μL，加入內(nèi)標溶液（20.2400μg/mL纈沙坦）20μL，加入5%甲酸溶液100μL，混合均勻后，加入甲基叔丁基醚3mL，渦旋混合60s，振蕩混合10min，離心6min（10000 rpm），轉(zhuǎn)移有機層至5mL離心管中，于40℃水浴中空氣流吹干，加入流動相400μL復溶，渦旋混合60s，將溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，離心3min（15000rpm），取上清液5μL進樣分析。

1.3.2.3 方法學驗證結(jié)果

采用HPLC-MS/MS法測定血漿中氯沙坦的濃度，結(jié)果表明，氯沙坦與內(nèi)標纈沙坦及血漿雜質(zhì)分離良好，在4.9950～599.4000ng/mL范圍內(nèi)線性關系良好，定量下限為4.9950ng/mL。氯沙坦提取回收率為74.9%～77.0%，批內(nèi)和批間精密度與準確度均符合相關規(guī)定，基質(zhì)效應不影響分析方法的準確度和精密度。

1.3.3 血漿樣品中氯沙坦羧酸（EXP3174）濃度的測定

1.3.3.1 色譜條件

分析柱：Hypersil BDS C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；預柱：琛航C18保護柱；流動相：0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液（pH =3.00±0.02）-乙腈-甲醇（50∶30∶20）；熒光波長：激發(fā)波長（Excitation）：250nm，發(fā)射波長（Emission）：375nm；流速：1.2mL/min；柱溫：30℃；進樣量：50μL。

1.3.3.2 血漿樣品處理

精密量取血漿樣品500μL，置10mL離心管中，加入甲醇-水（1∶1）溶液50μL，加入內(nèi)標溶液（1.0170μg/mL坎地沙坦）50μL，加入10%磷酸溶液100μL，混合均勻后，加入甲基叔丁基醚3mL，渦旋混合60s，振蕩混合10min，離心6min（10000 rpm），轉(zhuǎn)移有機層至5mL離心管中，于40℃水浴中空氣流吹干，加入復溶溶劑乙腈-水（45∶55）150μL復溶，渦旋混合60s，將溶液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，離心3min（15000 rpm），取上清液50μL進樣分析。

1.3.3.3 方法學驗證結(jié)果

采用HPLC-熒光法測定血漿中EXP3174的濃度，結(jié)果表明，EXP3174與內(nèi)標坎地沙坦及血漿雜質(zhì)分離良好，在4.8～958.0 ng/mL范圍內(nèi)線性關系良好，定量下限為4.8ng/mL。EXP3174提取回收率為67.2%～71.3%，批內(nèi)和批間精密度與準確度均符合相關規(guī)定。

1.4 統(tǒng)計方法

采用WinNonlin 6.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件計算完成試驗的23例志愿者血漿中的氯沙坦及EXP3174的主要藥動學參數(shù)，并對AUC0-t、AUC0-∞和Cmax經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行方差分析，雙單側(cè)t檢驗。Tmax采用非參數(shù)檢驗[3]。

1.5 安全性評價

臨床試驗醫(yī)師進行必要的安全性評價，采血期間定期監(jiān)測生命體征，保證每天至少2次詢問志愿者是否有任何不良事件，詢問時避免使用誘導性語言，監(jiān)護醫(yī)師應保證志愿者的安全。

2 結(jié) 果

2.1 數(shù)據(jù)計算和分析結(jié)果

23例志愿者口服受試制劑（T）和參比制劑（R）后氯沙坦、EXP3174的平均血藥濃度（Concentration）-時間（Time）曲線均數(shù)對比圖見圖1和圖2。

藥動參數(shù)使用WinNonlin 6.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進行計算。Tmax和Cmax均為實測值，血藥濃度-時間曲線下面積（AUC）按梯形面積法計算。計算得到的相應藥動學參數(shù)見表1。

對主要藥動學參數(shù)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行方差分析，并進一步采用雙單側(cè)t檢驗和[1-2α]置信區(qū)間法進行生物等效性評價，其中Tmax采用非參數(shù)檢驗法。結(jié)果表明，Cmax、AUC0-t、AUC0-∞均拒絕生物不等效假設，結(jié)果見表2。Tmax在受試制劑與參比制劑間無顯著性差異（P ＞0.05），結(jié)果見表3。根據(jù)以上結(jié)果，受試制劑參數(shù)AUC的90%置信區(qū)間落在了參比制劑相應參數(shù)的80 %～125 %范圍內(nèi)，受試制劑參數(shù)Cmax的90 %置信區(qū)間落在了參比制劑相應參數(shù)的75 %～133 %范圍內(nèi)，因此受試制劑和參比制劑具有生物等效性[4]。

圖1 氯沙坦平均血藥濃度-時間曲線均數(shù)對比圖（n=23）

圖2 EXP3174平均血藥濃度-時間曲線均數(shù)對比圖（n=23）

表1 氯沙坦、EXP3174主要藥動學參數(shù)[3]

表2 氯沙坦、EXP3174置信區(qū)間和個體內(nèi)變異結(jié)果（n=23）

表3 氯沙坦、EXP3174 Tmax的非參數(shù)檢驗結(jié)果（n=23）

2.2 安全性評價結(jié)果

兩個周期服藥后共有8例志愿者報告了不良事件，所有不良事件均為血壓下降，級別為輕度，并均在未經(jīng)任何醫(yī)學處理的情況下于該周期采血結(jié)束前恢復正常。試驗結(jié)束后再次對志愿者進行一般的體格檢查，項目與入組體檢項目相同，檢查結(jié)果均正常。

3 討 論

有報道，氯沙坦鉀可引起高鉀血癥[5]和低鈉血癥[6]，為了保證志愿者的安全，在入、出組血生化檢查中增加了血鉀和血鈉，從而避免入選血鉀或血鈉紊亂的志愿者。氯沙坦鉀作為降血壓的藥物，在本試驗期間僅發(fā)生8例血壓下降的不良事件，由此可見，氯沙坦的安全性很好，與眾多一線降血壓藥物相比有著明顯的優(yōu)勢。

從表2的數(shù)據(jù)可見，氯沙坦及EXP3174的個體內(nèi)變異系數(shù)均＜30%，故氯沙坦及EXP3174不屬于高變異藥物，因此23例志愿者可以滿足等效試驗的統(tǒng)計學要求。氯沙坦鉀在肝內(nèi)經(jīng)細胞色素P450酶（CYP3A4、2C9）轉(zhuǎn)化產(chǎn)生活性代謝產(chǎn)物氯沙坦羧酸[7]，本試驗受試制劑與參比制劑氯沙坦及EXP3174的藥動學參數(shù)分別與文獻[8-10]報道基本一致，而與非亞洲人種試驗的文獻[11,12]數(shù)據(jù)結(jié)果比較，代謝物EXP3174 Cmax和AUC結(jié)果相差較大，猜測這種差異可能源于不同人種體內(nèi)P450酶的差別。

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Studies on Bioequivalence of Losartan Potassium Tablet in Healthy Volunteers

JIN Jie*
(Actavis (Foshan) Pharmaceuticals Co Ltd, Foshan 528000, China)

ObjectiveTo establish a method for determination of losartan and its metabolite EXP3174 in human plasma.To evaluate the bioequivalence of 2 kinds of losartan potassium tablets in healthy volunteers.MethodsA single oral dose of 50 mg test or reference preparation was adminidtrated to 23 healthy male volunteers in a randomized cross-over study with 1 week washout interval.The plasma concentrations of losartan and EXP3174 were determined by HPLC-MS/MS and HPLC-FLU.The pharmacokinetic parameters were calculated and statistically analyzed by WinNonlin 6.0 software.ResultsThe pharmacokinetic parameters of losartan and EXP-3174 of test and reference preparation were as fllows: For losartan, Cmaxwere (244.8561±86.9741) ng/mL, (266.8621 ±115.5986) ng/mL; AUC0-twere (451.4±151.8) ng/(h·mL), (459.4±163.7) ng/(h·mL); AUC0-∞were (469.8±155.1) ng/(h·mL), (477.9±166.2)ng/(h·mL); t1/2were (1.55 ±0.32) h, (1.65±0.37) h; Tmaxwere (1.09±0.62) h, (1.25±0.75) h.For EXP3174, Cmaxwere (399.4±100.5) ng/mL, (426.8±132.6) ng/mL; AUC0-twere (3231± 1064) ng/(h·mL), (3152±1058) ng/(h·mL); AUC0-∞were (3458±1152) ng/(h·mL), (3408±1061) ng/(h·mL); t1/2were (6.86±2.25)h, (5.77±1.47) h; Tmaxwere (3.48±0.89) h, (3.13±0.69) h.ConclusionTest and reference drugs of losartan potassium are bioequivalent.

Losartan; EXP3174; HPLC-MS/MS; HPLC-FLU; Bioequivalence

R917

：B

：1671-8194（2013）02-0003-03

*通訊作者：E-mail：jjin@actavis.cn