堿性果膠酶生產(chǎn)菌株的產(chǎn)酶條件優(yōu)化

殷智超，金俊成，王修坤，張珍林

（1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安237012；2.皖西學(xué)院 材料與化工學(xué)院，安徽 六安237012；3.六安市人民醫(yī)院 燒傷整形外科，安徽 六安237005）

果膠酶是一類能夠分解果膠質(zhì)的復(fù)合酶類，在微生物及植物果實(shí)中廣泛存在，一般主要由果膠裂解酶（PL）、果膠酯酶（PE）和聚半乳糖醛酸酶（PG）等組成，人們通常提到的果膠酶是多種分解果膠的酶類總稱［1］。

堿性果膠酶是指堿性條件下具有較高酶活性的果膠酶。果膠酶一般應(yīng)用于果汁預(yù)處理等酸性條件，大部分果膠酶也只在酸性條件下具有高的酶活性。近年來，在一些堿性環(huán)境下，果膠酶也開發(fā)出較多的應(yīng)用，例如其在棉紡織預(yù)處理中的應(yīng)用，引起了人們的廣泛關(guān)注［2］。隨著環(huán)保健康紡織品需求量的加大以及環(huán)境保護(hù)力度的增加，在紡織印染行業(yè)中，一種應(yīng)用堿性果膠酶的新型紡織生物助劑在紡織印染行業(yè)中正應(yīng)用推廣［3］。另外，堿性果膠酶應(yīng)用于洗滌劑、植物藥物提取、生物技術(shù)、造紙等行業(yè)也成為研究的新熱點(diǎn)，受到越來越多的關(guān)注［4］。本文對(duì)自行篩選的堿性果膠酶生產(chǎn)菌進(jìn)行產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，以求得到能在堿性條件下具有較高活性的果膠酶，為堿性果膠酶在工業(yè)中的應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：自行從土壤中篩選得到的菌株G3，初步鑒定為黑曲霉（Aspergillus niger）。

斜面培養(yǎng)基 （w/v）：牛肉膏 0.3%、蛋白 胨1.0%、NaCl 0.5%、瓊脂1.8%，自來水定容，并調(diào)節(jié)pH＝7.4。

種子培養(yǎng)基（w/v）：果膠0.2%、MgSO40.05%、NaNO30.3%、K2HPO40.01%、FeSO40.001%、瓊脂1.8%，自來水定容，并調(diào)節(jié)pH＝7.4。

初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基（固體發(fā)酵）：果膠1.0%、NaNO30.5%、MgSO40.05%，自來水定容，并調(diào)節(jié)pH至7.4，以固液質(zhì)量比1∶1加入固體基質(zhì)木屑。

1.2 儀器

752型紫外可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；PHX智能型生化培養(yǎng)箱，寧波萊福科技有限公司；GZX－9240MBE型電熱恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

取斜面活化的孢子一環(huán)，接入50mL種子培養(yǎng)基，28℃、120r/min搖床振蕩培養(yǎng)24h，然后以5%（v/w）的接種量將種子液接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，將固體培養(yǎng)基打散，與種子液混勻，靜置恒溫培養(yǎng)箱，28℃培養(yǎng)5d。

1.3.2 粗酶液提取

向產(chǎn)酶培養(yǎng)基中加入2倍質(zhì)量的0.85%NaCl溶液，震蕩以充分混勻，靜置2h后以6層紗布過濾，過濾液為粗酶液。

1.3.3 酶活測(cè)定

采用3，5－二硝基水楊酸法（DNS法）［5］。加入1 mL 5g/L的果膠溶液，加入1mL pH10.0的甘氨酸－氫氧化鈉緩沖液，加入1mL待測(cè)酶液，搖勻，水浴鍋40℃恒溫反應(yīng)30min，取出試管迅速冷卻以終止酶反應(yīng)。加入1mL DNS試劑搖勻，沸水浴反應(yīng)5 min，取出迅速冷卻。加20mL蒸餾水稀釋，并以沸水浴加熱失活的粗酶液作空白對(duì)照，測(cè)定540nm下混合液的吸光度。

酶活定義：以果膠為底物，40℃，pH＝10.0條件下，定義1mL酶液60min催化果膠水解，每生成1 μg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位，用U表示。

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)

控制其他初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基條件不變，使果膠的含量分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，提取粗酶液，測(cè)定果膠酶活力。

控制其他初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基條件不變，使NaNO3的含量分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，提取粗酶液，測(cè)定果膠酶活力。

控制初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基條件不變，分別按照接種量2%、4%、6%、8%、10%進(jìn)行接種，發(fā)酵產(chǎn)酶，提取粗酶液，測(cè)定果膠酶活力。

1.3.5 正交試驗(yàn)

采用三因素三水平的正交試驗(yàn)方法討論果膠、NaNO3及接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生果膠酶酶活力的影響。設(shè)計(jì)方案見表1。

表1 果膠酶發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)表

1.3.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

以正交試驗(yàn)結(jié)果中的最優(yōu)組合作為提取條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算果膠酶酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠含量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

不同果膠添加量的發(fā)酵結(jié)果見圖1。

由圖1可知，果膠含量為0.2%時(shí)，酶活力最強(qiáng)。

圖1 果膠添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

2.2 NaNO3含量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

不同NaNO3添加量的發(fā)酵結(jié)果見圖2。

圖2 NaNO3添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

由圖2可知，NaNO3含量為0.8%時(shí)，酶活力最強(qiáng)。

2.3 接種量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

不同接種量的發(fā)酵結(jié)果見圖3。

圖3 接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

由圖3可知，接種量為6%時(shí)，酶活力最強(qiáng)。且繼續(xù)增加接種量，酶活會(huì)大幅度降低，可能是因?yàn)榻臃N時(shí)孢子數(shù)量過多，導(dǎo)致菌種初期生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)匱乏，后期總菌量降低，從而使酶活降低。

2.4 正交試驗(yàn)及驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)的結(jié)果如表2所示。

由正交試驗(yàn)結(jié)果（表2）可知，3個(gè)因素中對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶影響的主次順序?yàn)榻臃N量＞果膠添加量＞NaNO3添加量；其中接種量的影響最大，為主要因素，果膠添加量影響其次，NaNO3添加量影響最小；最優(yōu)產(chǎn)酶發(fā)酵條件組合為：果膠添加量0.3%，NaNO3添加量0.6%，接種量6%。

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)測(cè)得結(jié)果為：果膠酶酶活力為6 079U/mL。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本文采用單因素和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化了堿性果膠酶的生產(chǎn)工藝，研究了果膠添加量、NaNO3添加量及接種量對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶的影響。最佳發(fā)酵條件為果膠添加量0.3%、NaNO3添加量0.6%、接種量6%。此配比下果膠酶酶活力為6 079U/mL。在采用誘變等其他方法進(jìn)一步提高產(chǎn)酶酶活后，將探討制作酶干粉制劑，并研究其果膠酶酶活。

［1］王步江，姜丹，涂然.嗜熱堿性果膠酶產(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38（5）：117－121.

［2］Kashyap D R，Vohra P，Chopra S.Biotechnologiical Applications of Microbial Pectinases［J］.Bioresource Technology，2001，（77）：215－227.

［3］李建洲，李江華，許正宏，等.嗜鹽嗜堿菌Alkalibacteriumsp.F26產(chǎn)堿性果膠酶發(fā)酵條件的優(yōu)化［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2005，24（6）：43－48.

［4］劉曦，路福平，黎明，等.堿性果膠酶高產(chǎn)菌株產(chǎn)酶條件的優(yōu)化［J］.生物技術(shù)，2008，18（6）：71－74.

［5］江潔，劉曉蘭.果膠酶活性分光光度計(jì)測(cè)定方法的研究［J］.齊齊哈爾大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，（1）：63－66.