皖西食用百合莖尖脫毒培養(yǎng)

張傳海，孫傳伯，謝升旺，王維杰，唐文娟，程夢(mèng)思

（1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安237012；2.安徽中升生物科技有限公司，安徽 霍山237200）

百合是百合科百合屬（Lilium）植物的總稱，全世界共有90余種。我國是世界百合的起源中心，原產(chǎn)于我國的約有46種18變種［1］。百合是藥食同源的多年生草本經(jīng)濟(jì)作物，根據(jù)其用途可分為食用、藥用和觀賞百合等3類，其中，食用百合被視為“蔬菜人參”，具有潤肺、祛痰、健胃、清熱利尿等功效［2］。

我國擁有非常悠久的食用百合栽培歷史，近年來隨著人民生活水平的不斷提高和百合需求量的日益增長，百合種植面積也在迅速擴(kuò)大，成為宜栽地區(qū)調(diào)整農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的重要作物品種之一。地處皖西大別山區(qū)的六安市霍山、金寨、舒城、裕安等縣區(qū)，食用百合的年種植面積達(dá)5萬畝以上，已發(fā)展成為區(qū)域性特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)［3］。然而，對(duì)霍山等地百合種植區(qū)的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，近年來以灰霉病、葉尖干枯病、炭疽病以及病毒病等為主的百合病害日趨嚴(yán)重［4］，直接影響到百合生產(chǎn)的正常進(jìn)行，對(duì)百合產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展構(gòu)成了威脅。

現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中，百合的繁殖主要是依靠鱗莖進(jìn)行無性擴(kuò)繁，在此模式下，一旦母球感染病毒，就會(huì)在植株體內(nèi)不斷積累并傳代，形成長期危害。要解決因病毒侵染導(dǎo)致的種性退化問題，利用莖尖培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)百合脫毒種苗是一條可行的途徑［5］。

本文以皖西食用百合主栽品種卷丹（Lilium lancifoliumThunb）的鱗莖為材料，開展百合鱗莖的莖尖離體培養(yǎng)研究，重點(diǎn)探討不同激素條件對(duì)不定芽的誘導(dǎo)發(fā)生、繼代增殖以及誘導(dǎo)生根等的影響，旨在為建立皖西食用百合脫毒種苗生產(chǎn)技術(shù)體系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

以食用百合卷丹的新鮮鱗莖為材料，濕沙埋藏備用。

1.1.2 儀器

電熱蒸汽滅菌器（YX-450，上海三申），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化），體視顯微鏡（SZX7-1093，奧林巴斯），恒溫培養(yǎng)箱（PYX-150HA，科立儀器）。

1.1.3 試劑

乙醇，HgCl2，6-芐氨 基 嘌 呤 （6-BA），萘 乙 酸（NAA），MS培養(yǎng)基所需試劑。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的種類與配制

芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基：MS＋蔗糖30g／L＋0.05%活性炭＋瓊脂粉4.5g／L＋植物激素組合（表1、2）；用15mm×80mm的指管進(jìn)行分裝。

不定芽增殖的培養(yǎng)基：MS＋蔗糖30g／L＋瓊脂粉4.5g／L＋植物激素組合（表3）；用容積250mL、帶透氣孔的培養(yǎng)瓶分裝，每瓶50mL。

誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基：1／2MS＋蔗糖25g／L＋瓊脂粉4.5g／L＋植物激素組合（表4）；用容積250mL、瓶蓋帶透氣孔的塑料培養(yǎng)瓶分裝，每瓶約50mL。

上述各類培養(yǎng)基的配制，皆按常規(guī)流程進(jìn)行，調(diào)整pH值至5.9，分裝后，高壓濕熱滅菌，冷凝備用。

1.2.2 鱗莖的預(yù)處理

熱處理組：取百合鱗莖，用自來水洗凈外表，剝?nèi)ネ鈱喻[片，使鱗莖直徑縮小至1.5cm左右，裝于小型塑料自封袋中，置于42℃恒溫培養(yǎng)箱中避光保溫處理72h，然后進(jìn)入莖尖剝離操作步驟。

未熱處理組：在接種的當(dāng)天，取百合鱗莖，用自來水洗凈外表，剝?nèi)ネ鈱喻[片，然后進(jìn)入莖尖剝離操作程序。

1.2.3 鱗莖的消毒與莖尖剝?nèi)?/p>

鱗莖的消毒：取預(yù)處理后的百合鱗莖（熱處理組和未熱處理組要分開），用自來水清洗外表，瀝水，在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行表面消毒：先用75%乙醇浸潤10 s，快速倒去乙醇，用無菌水浸洗2～3次，然后將鱗莖轉(zhuǎn)入0.1%HgCl2溶液中浸泡消毒10min，再用無菌水清洗4～5遍，瀝水，置于無菌培養(yǎng)皿中。

莖尖剝?nèi)『徒臃N：消毒好的每個(gè)鱗莖，先用肉眼剝?nèi)ネ獠亏[片，再在體視顯微鏡下快速剝?nèi)≈睆?.5～1.0mm大小的莖尖，迅速接種到各芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.2.4 莖尖接種和芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

每支芽誘導(dǎo)指管培養(yǎng)基上接種1個(gè)莖尖，每個(gè)激素處理組共接種10個(gè)莖尖。接種完成后，轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)箱中集中培養(yǎng)，誘導(dǎo)不定芽發(fā)生。培養(yǎng)條件：溫度（24±2）℃，光照強(qiáng)度1500lx，光照時(shí)間12h／d。定期觀察莖尖生長發(fā)育進(jìn)程，培養(yǎng)至第45d，統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)發(fā)生情況。

1.2.5 不定芽的繼代增殖培養(yǎng)

將莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生的不定芽分成單個(gè)后，轉(zhuǎn)接到各組芽增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每個(gè)激素處理組接種5瓶、共15個(gè)不定芽，培養(yǎng)條件與上述芽誘導(dǎo)的相同。培養(yǎng)至30d，統(tǒng)計(jì)不定芽的增殖情況。

1.2.6 誘導(dǎo)生根培養(yǎng)

繼代增殖后，將帶葉無根芽苗分成單株，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，每一激素處理組接種5瓶、共15個(gè)芽苗，培養(yǎng)條件同芽誘導(dǎo)。培養(yǎng)至第25 d，統(tǒng)計(jì)生根情況。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

平均芽分化量＝誘導(dǎo)發(fā)生的不定芽總數(shù)／產(chǎn)芽的總莖尖數(shù)；不定芽誘導(dǎo)率（%）＝（產(chǎn)生不定芽的莖尖數(shù)／成活的莖尖數(shù)）×100；芽增殖系數(shù)＝增殖后的不定芽總數(shù)／接種的不定芽總數(shù)；芽增殖率（%）＝（新增殖的不定芽數(shù)／接種的不定芽總數(shù)）×100；生根誘導(dǎo)率（%）＝（生根的不定芽數(shù)／接種的不定芽數(shù)）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 不定芽的誘導(dǎo)發(fā)生

觀察了各處理的不定芽誘導(dǎo)發(fā)生進(jìn)程。總體上，接種后第6d左右莖尖即啟動(dòng)生長；第12d，成活的莖尖開始膨大變綠；第20d，不定芽明顯形成，而未成活的莖尖變褐枯死；第26d，不定芽增殖形成叢芽，幼葉抽展，成為帶葉的無根芽苗。

培養(yǎng)至45d，對(duì)不定芽的分化發(fā)生情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表1和表2。在熱處理組和未熱處理組中，不同激素組合對(duì)不定芽的誘導(dǎo)效應(yīng)表現(xiàn)出較高的一致性；熱處理組和未熱處理組皆以6-BA 1.0 mg／L＋NAA 0.2mg／L的激素組合為優(yōu)，其在熱處理組的芽誘導(dǎo)率為88.9%，平均芽分化量為4.5個(gè)，在未熱處理組的芽誘導(dǎo)率為87.5%，平均芽分化量為4.9個(gè)。總體上，鱗莖的熱處理對(duì)于后期接種莖尖的成活和芽分化呈現(xiàn)負(fù)向作用，表現(xiàn)為芽誘導(dǎo)率和平均芽分化量皆有一定程度下降，但與未熱處理組相比較，不定芽發(fā)生情況并無顯著差異。

表1 熱處理組的莖尖培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽發(fā)生情況

2.2 不定芽的繼代增殖

將誘導(dǎo)發(fā)生的不定芽分組轉(zhuǎn)接到芽增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至第30d，統(tǒng)計(jì)各激素處理組的不定芽增殖情況。結(jié)果（表3）表明，適當(dāng)降低6-BA和NAA的使用濃度有利于不定芽的增殖和生長，較高濃度水平的6-BA對(duì)于不定芽的增殖反而有抑制作用。

表3 外源植物激素對(duì)莖尖培養(yǎng)不定芽增殖的影響

在設(shè)定的各激素處理組中，以6-BA 0.5mg／L＋NAA 0.2mg／L的激素組合為佳，芽增殖系數(shù)為最高的4.20，芽增殖率為320%。而不添加任何外源激素的對(duì)照組，不定芽的增殖效率最低，表明外源植物激素對(duì)于百合不定芽的增殖培養(yǎng)是必需的。

2.3 外源植物激素對(duì)不定芽的誘導(dǎo)生根效應(yīng)

本實(shí)驗(yàn)的生根培養(yǎng)基中，NAA 設(shè)置0.1、0.5、1.0、1.5mg／L共4個(gè)濃度水平，與6-BA的0.2、0.5 mg／L進(jìn)行完全組合，另以不加任何植物激素的為對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4。

將不定芽接種到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至第7～10 d，不定芽的基部開始長出毛狀白根，20～25d不定根出齊。培養(yǎng)至第30d，統(tǒng)計(jì)分析誘導(dǎo)生根情況，結(jié)果見表4。有2個(gè)激素組的生根率達(dá)到100%，但以NAA 1.0mg／L＋6-BA 0.2mg／L組的誘導(dǎo)生根效果最好，根系較發(fā)達(dá)、健壯。

表4 植物激素對(duì)百合不定芽誘導(dǎo)生根的影響

3 討論

筆者前期以卷丹的鱗片為外植體，研究了植物激素對(duì)不定芽分化發(fā)生、繼代增殖以及誘導(dǎo)生根的影響［6］。在此基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步探討了卷丹的莖尖離體培養(yǎng)基本條件。將莖尖分化實(shí)驗(yàn)分為熱處理和未熱處理兩組，結(jié)果表明，兩組皆以6-BA 1.0mg／L＋NAA 0.2mg／L的激素組合對(duì)于不定芽的分化發(fā)生為優(yōu)；鱗莖的熱處理對(duì)于莖尖的成活和芽分化表現(xiàn)出一定程度的負(fù)影響，但總體上與未熱處理組的差異并不顯著。不定芽的繼代增殖培養(yǎng)，以6-BA 0.5mg／L＋NAA 0.2mg／L的激素組合最佳，芽增殖系數(shù)為4.20，芽增殖率達(dá)320%。芽誘導(dǎo)生根實(shí)驗(yàn)中，以6-BA 0.2mg／L＋NAA 1.0mg／L組的誘導(dǎo)生根效果最好，根數(shù)較多，且根系健壯。

植物莖尖培養(yǎng)是一項(xiàng)成熟的現(xiàn)代生物技術(shù)，已成功應(yīng)用于多種植物的脫毒苗規(guī)模化生產(chǎn)。侵入植物的病毒一般需要通過維管組織進(jìn)行轉(zhuǎn)移，但莖尖分生組織尚未形成維管束，幾乎不含或很少含有病毒，因此，剝?nèi)∏o尖無毒生長點(diǎn)進(jìn)行離體培養(yǎng)和擴(kuò)繁，便可能獲得大量的脫毒苗。莖尖成活率和再生苗的脫毒率，可作為衡量莖尖培養(yǎng)是否成功的重要指標(biāo)。

研究表明，一定的高溫處理能將病毒鈍化，使其失去活性；但單純對(duì)植物材料進(jìn)行熱處理，脫毒率較低。將熱處理與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合，則可大大提高脫毒效率。本實(shí)驗(yàn)先對(duì)食用百合的鱗莖外植體分為熱處理和未熱處理兩種預(yù)處理，然后再進(jìn)行莖尖培養(yǎng)比較試驗(yàn)，目的是探討在兩種預(yù)處理情況下的莖尖成活與分化情況以及脫毒效果的差異。關(guān)于兩組試驗(yàn)再生苗的脫毒效果如何，將另作分析報(bào)道。

建立百合脫毒種苗生產(chǎn)技術(shù)體系和繁育基地，對(duì)于促進(jìn)百合產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要現(xiàn)實(shí)意義。然而，百合的脫毒種球生產(chǎn)供應(yīng)并不那樣簡單。從脫毒苗繁育，到種苗移栽和種球繁殖，再到種球的后期加工貯藏，需要形成完整配套的生產(chǎn)技術(shù)體系和標(biāo)準(zhǔn)，而且還涉及生產(chǎn)管理模式和成本控制等一系列基礎(chǔ)環(huán)節(jié)［7］。在國內(nèi)，關(guān)于百合的脫毒快繁已有不少相關(guān)研究報(bào)道［8-10］，從現(xiàn)實(shí)情況看，要將這些研究成果應(yīng)用于生產(chǎn)，真正形成自己的技術(shù)體系，建立完善的生產(chǎn)基地，還有相當(dāng)多的問題需要加以解決。

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